地球上的生命过程依赖于植物的光合作用,光合作用可以产生大量的以木质纤维素为主要组分的生物质,所以木质纤维素是地球上存在的可持续满足人类生存和发展需要的规模最大的可再生资源。随着石油资源的枯竭及人类社会对环境可持续发展的要求,开发利用清洁、环境友好型能源成为人类社会的广泛共识。利用微生物技术高效转化纤维素类可再生资源,发酵生产乙醇、乳酸等液体燃料和各种化工产品,对于我们这样一个人口众多,能源和资源紧张的国家具有十分重要的战略意义、现实意义和广阔的发展前景。瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是一株重要的纤维素酶工业生产菌株,它有很高的分泌纤维素酶降解木质纤维素的能力。2008年其基因组测序结果表明,与其它已经完成测序的丝状真菌相比,瑞氏木霉基因组中糖苷水解酶的编码基因较少；而前期研究结果表明：在瑞氏木霉体内,主要的纤维素酶组分纤维二糖水解酶Ⅰ(CBHI)的生物合成过程需要4分钟,而其分泌过程则需要11分钟完成,这要比酵母或其它丝状真菌细胞内蛋白的分泌时间长。初步推测,瑞氏木霉的高纤维素降解能力并不是由其所分泌纤维素酶系的多样性决定,而可能取决于其体内存在的较强的蛋白分泌能力。研究发现,真核生物细胞中转录翻译的内源尤其是外源蛋白如果不能高效地进入内质网,或在内质网中不能高效地正确折叠将引发非折叠蛋白应急反应(unfolded protein response, UPR),协调各种其它蛋白因子参与协助分泌蛋白的有效折叠和分泌,同时亦可能反馈抑制所分泌蛋白基因的转录表达。因此与纤维素酶基因的诱导转录相比,其纤维素酶的高效分泌更可能是限制其大量表达的主要瓶颈。综上所述,本论文的研究工作主要包括以下两个方面：1.瑞氏木霉蛋白折叠因子Calnexin及PrpA缺失菌的构建及性质测定凝集素蛋白Calnexin是内质网内重要的分子伴侣,它可以识别只有一个葡萄糖残基的N-糖链并与之结合,从而辅助糖蛋白多肽链的折叠；而PrpA (PDI related protein A)是内质网内涉及蛋白折叠的PDI相关蛋白。在有纤维素酶的诱导底物存在的条件下,它们的转录量明显提高。首先在瑞氏木霉内将Calnexin及PrpA的编码基因进行敲除,并对缺失菌的性质进行初步测定。对获得的缺失菌的性质进行了初步测定,发现Calnexin和PrpA缺失后并没有影响菌体在各种碳源上的生长。在纤维素底物存在的诱导条件下,prpA缺失菌所分泌的总蛋白量及酶活与野生型没有明显区别,而cnel缺失菌虽然分泌的总蛋白量与野生型没有明显变化,但是pNPC和pNPG水解酶活性都要明显高于野生型菌株。2.Acne1菌株CBHI的产生分泌、稳定性分析及分离纯化由于Calnexin是存在于内质网中的重要的分子伴侣,它的缺失可能会给菌体带来以下两个方面的影响：(1)内质网质量控制系统的严谨性受到破坏,非正确折叠的蛋白可以被分泌到胞外,而这种非正确折叠蛋白可能由于构象的改变使缺失菌与野生型产生了明显的表型差异；(2)多肽链的折叠受到影响,不能够正常分泌而滞留引起胞内产生一系列复杂的非折叠蛋白应急反应。所以为深入分析Calnexin缺失菌的表型,我们对缺失菌分泌的主要纤维素酶CBHI的产生分泌情况及稳定性进行了分析,并对分泌到胞外的CBHI进行分离纯化。结果表明：Calnexin缺失后,主要的纤维素酶组分CBHI在诱导12小时时便可检测到较强的胞内信号,并且随着诱导时间的延长,胞内信号强度逐渐减弱；而在胞外分泌CBHI的含量及其稳定性方面,Δcne1菌株与野生型却没有明显区别。发酵液中的酶组分经过浓缩后通过两步离子交换层析进行分离纯化,并对得到的纯组分的pNPC水解酶活性进行测定。结果表明：Δcne1菌株分泌产生的CBHI的pNPC水解酶活性与野生型并没有明显差别：而对菌体发酵液中全蛋白进行检测时,发现Δcne1菌株与野生型菌株间存在着一条明显的差异蛋白,该差异蛋白通过质谱鉴定被确定为p-葡萄糖苷酶Cel3b,所以Δcne1菌株较高的pNPC水解酶活性可能是由这一差异蛋白引起。我们同时还通过免疫共沉淀的方法来分离瑞氏木霉体内可能存在的辅助纤维素酶高效折叠分泌的特殊的蛋白折叠因子。分离鉴定工作还在进行中。