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犬新孢子虫(Neospora caninum,N.caninum)是一种胞内寄生性原虫,属于顶复门原虫。新孢子虫病呈全球性分布,给养牛业造成巨大的经济损失,世界范围内针对新孢子虫病尚无特效药物或疫苗。新孢子虫入侵宿主细胞是虫体突破机体防线的关键节点,其入侵过程主要为识别并黏附宿主细胞形成滑动连接体MJ侵入细胞后定殖。入侵过程取决于多种蛋白质在寄生虫和宿主细胞之间的相互作用,因此,研究新孢子虫入侵机理有助于发现与入侵相关的基因和宿主靶标。近年来的研究表明弓形虫RON2/4/5/8与顶膜抗原-1(AMA1)组成的复合体是MJ的关键结构,新孢子虫顶膜抗原-1可与多种蛋白相互作用,但同RON2之间是否存在相互作用还尚未得到证实。因此本研究拟利用GST-Pull down和双分子荧光互补技术确定新孢子虫AMA1与RON2之间是否存在相互作用,利用免疫荧光技术(IFA)对新孢子虫AMA1与RON2进行亚细胞定位,并进行新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠和山羊的免疫保护性研究,为新型抗新孢子虫药物及疫苗靶标的开发提供参考。Nc AMA1与Nc RON2互作的GST-Pull down鉴定:GST-Pull down实验发现通过纯化后的p GEX-4T-Nc RON2载体蛋白与p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白共孵育后,Western blot实验确定洗脱液中发现存在含His标签的p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白条带,GST标签蛋白与p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白共孵育得到的洗脱液中没有发现存在含His标签的p ET-28a-Nc AMA1载体蛋白条带,证明了新孢子虫Nc AMA1与Nc RON2存在体外互作现象。Nc AMA1与Nc RON2互作的双分子荧光互补鉴定:构建双分子荧光互补载体p Nc AMA1-HA-KN151与p Nc RON2-Myc-LC151,激光共聚焦观察Nc AMA1和Nc RON2共转染试验组可以发出红色荧光,两个蛋白在细胞内的相互作用被进一步证明。Nc AMA1与Nc RON2蛋白的亚细胞定位:Nc AMA1蛋白在激光共聚焦显微镜下定位表达于虫体顶部显现绿色荧光,Nc RON2蛋白在激光共聚焦显微镜下定位于虫体与VERO细胞膜交界处显现橙红色荧光,且与Nc AMA1有共定位情况。证明了Nc AMA1与Nc RON2蛋白在新孢子虫黏附入侵阶段存在共定位情况和互作关系。通过免疫荧光亚细胞定位研究,新孢子虫AMA1与RON2蛋白作为新孢子虫入侵的指示抗原,研究新孢子虫AMA1与RON2蛋白在新孢子虫入侵时蛋白互作的位置,这有助于了解其生物学功能及相互之间存在的作用关系。Nc AMA1与Nc RON2黏附入侵阻断试验:利用抗体中和阻断技术进行试验,发现了新孢子虫AMA1与RON2蛋白多抗有效的降低了新孢子虫速殖子的入侵率,在多抗稀释比例为1:50时效果最佳,分别为AMA1多抗组降低36%、RON2多抗组降低39%和AMA1+RON2多抗组降低41%(p<0.001),其中AMA1+RON2混合组阻断效果最好。但对新孢子虫速殖子的胞内增殖速度影响不大。Nc AMA1与Nc RON2对小鼠的免疫保护性研究:通过对小鼠免疫攻虫后发现,Nc AMA1和Nc RON2蛋白免疫小鼠后,小鼠的血清抗体效价和细胞因子水平显著提升(p<0.001),且AMA1+RON2蛋白免疫组免疫效果最好;AMA1+RON2蛋白免疫攻虫组的小鼠生存率最高为25%,其他组小鼠均为0,同时AMA1+RON2蛋白免疫攻虫组的小鼠的脑组织荷虫量和组织损伤程度最低,说明了混合免疫效果优于单独免疫。显示了新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠具有较好的免疫保护性。Nc AMA1与Nc RON2混合免疫对山羊的保护性研究:通过对山羊免疫攻虫后发现Nc AMA1和Nc RON2蛋白免疫山羊后,山羊的血清抗体效价和细胞因子水平显著提升(p<0.001),山羊的脑组织荷虫量显著降低其减虫率为56%(p<0.01),心、肝、脾、肺、肾、脑组织病理变化有明显的减轻,说明Nc AMA1+Nc RON2蛋白混合免疫后对于山羊具有一定免疫保护作用。综上所述,本研究利用GST-Pull down技术、双分子荧光互补技术和亚细胞定位技术鉴定了新孢子虫AMA1与RON2蛋白之间存在相互作用,且通过黏附入侵阻断试验证明了新孢子虫AMA1和RON2蛋白参与了新孢子虫入侵细胞过程,最后通过小鼠和山羊的免疫保护性研究试验证明了新孢子虫AMA1与RON2蛋白对小鼠和山羊具有较好的免疫保护性,为防控新孢子虫感染提供了理论依据。