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口蹄疫(FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的牛、猪、羊等偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病,国际兽医局将其列为“A类烈性传染病”之首,一旦爆发,必须捕杀感染及接触感染的动物,不仅造成巨大的经济损失,而且严重危害畜牧业的发展。目前,大多数流行FMD的国家以疫苗免疫为主的措施预防FMD。然而,FMDV具有7个血清型且变异快,不同血清型疫苗之间没有交叉免疫保护反应,故通过疫苗单一手段很难控制和根除FMD,因此科学家们在注重疫苗研发的同时,开始关注病毒和宿主之间的关系,尤其是病毒受体在病毒感染过程中的作用,期望通过敲除或沉默病毒的关键受体阻断病毒的感染,进而达到控制和根除FMD的目的。研究表明,整联蛋白(Integrin) αvβ6是FMDV感染并致病的最重要的病毒受体,它可与所有血清型的FMDV结合。敲除整联蛋白通用亚基αv基因的转基因小鼠死胎率高、生长发育异常且易发生肿瘤,因此,αv基因不是抗FMD研究的理想受体基因;β6是启动FMDV强毒感染的决定性受体亚基,敲除整联蛋白β6亚基基因的转基因小鼠生长发育正常。因此,敲除整联蛋白β6亚基是阻断病毒感染的关键途径,为研制控制和根除FMD的药物提供靶点。传统的基因打靶效率低,周期长。因此,近年来人们不断尝试发现新的基因打靶技术并应用于基因研究中,其中,锌指核酸酶技术已经成为基因打靶的一个高效、有力的工具,可在细胞和个体水平上进行基因操作,并成功应用于多种动物的基因修饰。本研究采用手术方法取出45日龄的荷斯坦奶牛胎儿,利用胶原酶IV消化法,培养了原代奶牛胎儿成纤维细胞系,并对其F0及F1代进行了大量冻存,以备后续实验的使用。根据NCBI上公布的牛整合素β6基因序列设计引物,以实验室分离培养的原代奶牛胎儿成纤维细胞的DNA为模板,扩增β6基因,并进行测序,测序结果提交SIGMA公司,定制针对integrin β6亚基基因的锌指核酸酶。对电转染的程序进行优化,最终选择U-023作为电转染原代奶牛胎儿成纤维细胞的程序,ZFNs采用此程序电转染原代奶牛胎儿成纤维细胞,T-A克隆、DNA测序并与野生型序列进行比对,确定切割位点发生突变的细菌克隆数,突变数/送测总数就是ZFN针对靶DNA切割的打靶效率,约为22.9%,有限稀释法制备单克隆细胞,克隆环挑取细胞克隆并进行扩大培养,按打靶效率检测方法进行鉴定,获得阳性细胞克隆25个,其基因突变类型分为三种:基因的添加(2/25,8%)包含1个纯合子一个杂合子、敲除(17/25,68%)包含8个纯合子和9个杂合子及混合细胞克隆(6/25,24%)包含6个杂合子。针对ZFNs切割位点设计了含有无启动子的GFP基因的同源打靶载体pβ6LNGR,线性化同源打靶载体并与ZFNs共转染原代奶牛小肠上皮细胞,倒置荧光显微镜下观察到GFP的表达,初步验证ZFNs介导发生同源重组,单转线性化的pβ6LNGR质粒,未观察到GFP表达。随后两者共转染原代奶牛成纤维细胞,经G418筛选10天,挑取克隆,PCR方法进行鉴定,获得阳性细胞克隆10个,其中1个纯合子9个杂合子,初步验证ZFNs介导的同源打靶效率为3.6%,单转并未获得阳性克隆细胞。本研究为抗FMD的药物提供靶点,同时为FMD侵染机制研究及其它功能基因的插入奠定基础。