论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎最主要的致病菌之一,感染率很高。本试验利用金黄色葡萄球菌人工感染中国荷斯坦奶牛乳腺,并观察感染后奶牛的全身反应,同时进行乳腺炎临床诊断、细菌检测以及乳腺组织病理学检查：采用Affymetrix牛基因组表达谱芯片技术在全基因组范围内分析了金黄色葡萄球菌人工诱导奶牛实验性乳腺炎的基因表达谱差异,利用Q-PCR、ELISA、Western Blot方法对基因芯片的结果进行了验证,同时对差异表达基因进行GO和Pathway等功能分析；以依电压钙离子通道α2β1(CACNA2D1)为乳腺炎抗性候选基因,进行了该基因与奶牛体细胞评分(Somatic Cell Score,SCS)关联分析研究。主要结果如下：1.本试验成功的构建了金黄色葡萄球菌人工感染奶牛临床型乳腺炎的疾病模型,攻菌后奶牛表现出明显的临床型乳腺炎症状,该模型真实地反映了金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺炎的自然发病过程。2.表达谱基因芯片分析共筛选出显著差异表达基因305个,其中161个基因上调表达,144个基因下调表达(FC>2,P<0.05)。利用Q-PCR技术对部分差异表达基因进行验证(IL8、CSN1S1、CDI4、TLR4、STAT5A、S100A12、LBP、IL-1β、MFGE8、SELENBP1),结果表明Q-PCR分析结果与基因芯片结果一致,说明基因芯片试验筛选到的差异表达基因具有真实可靠性。3.差异表达基因的G0功能分类分析,发现这些基因共涉及到138个GO Terms (P<0.05)。Pathway通路分析共筛选到9条显并的Pathway,分别是：TOLL样受体信号通路,NOD样受体信号通路,细胞质DNA识别通路,造血干细胞谱系,细胞因子与细胞因子相互作用通路,RIG-I样受体信号通路,趋化因子信号通路,MAPK信号通路,B细胞受体信号通路,进一步筛选参与这些Pathway的枢纽差异表达基因,最终得到了27个关键基因：IL8、TLR4、TLR2、CD36、CD14、CD40、LBP、CXCL10、IL6、CXCL5、IL1A、IL1B、IL6R、BIRC3、CACNA2D1、CCL2、DAPP1、DUSP10、IKBKE、LGP2、MKNK1、VAV1、PRKCA、PTPN5、SOS2、TNFSF13B、NFKBIA,这些基因为奶牛乳腺炎的抗性研究提供了重要的参考候选基因群。4.利用ELISA技术对乳腺组织中白细胞介素8 (Interleukin-8, IL8)和αS1-酪蛋白(αS1-casein,CSNIS1)含量的变化检测时发现,炎症因子IL8在患乳腺炎乳腺组织中高表达而奶中含量最丰富的蛋白CSNIS1却明显低表达,对照组正好相反,这与奶牛乳腺炎实际炎症生理过程相符。5. Western Blot检测结果表明,IL8和STAT5A蛋白在患病组与正常组乳腺组织中均有表达,但是其蛋白表达量存在显著差异,经人工感染后的奶牛乳腺组织中IL8蛋白表达量显著高于正常组,而STAT5A蛋白表达量则明显低于正常组,该结果也从蛋白质水平上证明了基因芯片结果的正确性。6. CACNA2D1基因与奶牛体细胞评分关联分析结果表明,G519663A与A526745G位点GG基因型SCS值显著低于AG与AA基因型,可初步将CACNA2D1作为奶牛乳腺炎候选基因进行深入研究。