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妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins,PAGs)是母牛胎儿滋养层细胞合成和分泌的一类糖蛋白,在母牛的妊娠过程中起着重要作用。通过检测体液中的PAGs浓度,能够快速有效地对奶牛进行早期妊娠诊断,尽早地检出空怀牛,提高牧场的繁殖效率和经济效益。因此,本试验对PAGs检测试剂盒的应用效果、奶牛PAGs的分离鉴定以及PAG4基因的原核表达和多克隆抗体的制备进行研究,以期为PAGs相关检测产品的研发提供技术支持。研究结果如下:试验一:PAGs检测试剂盒在奶牛早期妊娠诊断上的应用试验采集49头人工授精(Artificial Insemination,AI)后28~32 d奶牛血液样品,分离血清并应用PAGs检测试剂盒进行检测;采血当天利用兽用B超仪进行妊娠检查,并于AI后35 d用B超复检。结果表明:PAGs检测试剂盒检测奶牛早期妊娠的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确性分别为92.0%、95.8%、95.8%、92.0%、93.9%,与B超检测方法结果的一致性(Kappa值)为0.632。试验二:奶牛PAGs的分离鉴定从屠宰场收集4份奶牛胎儿胎盘,分别采用饱和硫酸铵沉淀、阴离子层析、SDS-PAGE凝胶电泳和液相色谱-质谱(liquid chromatograph-mass spectrometric,LC-MS)四种方法进行分离鉴定。结果显示:纯化的目的蛋白相对分子质量在55 kD左右;LC-MS成功分离鉴定出PAG1、PAG2、PAG6、PAG7、PAG9、PAG12、PAG13、PAG22共8种天然蛋白。试验三:奶牛PAG4基因的原核表达及多克隆抗体的制备将体外扩增的PAG4目的片段克隆至pET28a原核表达载体后,转化大肠杆菌DH5a,对菌液PCR鉴定的阳性克隆进行测序。提取测序正确菌液的质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达PAG4重组多肽。将纯化后的PAG4重组多肽免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,分别采用间接ELISA法和western blot法检测抗体效价与抗体特异性。结果表明:试验成功构建了PAG4多肽的原核表达载体,并获得纯化的PAG4重组多肽;制备的多克隆抗体效价高达1:24,000,与重组多肽蛋白、天然组织蛋白均有特异性反应,并可在一定程度上区分妊娠奶牛和未妊娠奶牛血清。