论文部分内容阅读
滋养细胞(trophoblast,TB)是构成哺乳动物胎盘组织的重要功能细胞,在正常早期妊娠过程中,滋养细胞通过“节制性”的“生理侵袭”能力到达子宫肌层约1/3处的母体蜕膜组织,促使螺旋动脉重铸、扩张,进而满足正常生理妊娠过程中母胎间的营养供给和血液供应。正常生理状态下,滋养细胞的这种“生理性侵袭”具有明显的时间性和空间性,即滋养细胞的侵袭功能仅发生在妊娠早期阶段,在妊娠12周时达到高峰,然后逐渐减弱在妊娠14-20周时基本结束;同时滋养细胞仅侵袭到子宫肌层1/3处,而对深层组织无影响。病理状态下,滋养细胞侵袭功能异常将直接导致妊娠相关疾病的发生,如滋养细胞过度侵袭,破坏周围组织会导致绒毛膜癌等肿瘤疾病的发生;而在子痫前期(preeclampsia,PE)发病过程中,由于多种因素共同作用导致滋养细胞植入深度不足,进而使螺旋动脉的植入和重铸受到限制,最终导致流产、胎盘缺血、发育受限等。由此可见,滋养细胞的这种“生理性的侵袭功能”是受精卵的成功植入和胚胎发育的重要前提,但目前关于其侵袭功能的具体调控机制尚不完全清楚。本课题组前期研究中发现,5%蜕膜基质条件培养液(decidual stromal conditioned medium,DSCM)处理后的HTR-8/SVneo细胞侵袭和迁移能力明显增强,同时MMP-2表达水平和酶活性显著增强;而20%DSCM处理后HTR-8/SVneo细胞侵袭和迁移能力明显减弱,MMP-2表达及酶活性显著降低。随后我们通过蛋白芯片比对不同处理组中差异表达的细胞因子后发现,5%DSCM处理后的HTR8/SVneo细胞中angiogenin表达明显增加,而20%DSCM处理后angiogenin表达显著减低,angiogenin表达水平与滋养细胞侵袭能力密切相关,因此推测angiogenin可能对滋养细胞侵袭和迁移功能发挥重要调控作用。目的及方法针对上述问题,在前期研究的基础上,我们拟通过q PCR和Western blot方法明确Angiogenin在不同滋养细胞系和临床样本中的表达;在构建过表达质粒和si RNA的基础上,使用Transwell实验和划痕实验验证Angiogenin对滋养细胞侵袭和迁移功能的调控作用;通过q PCR、Western blot、报告基因实验和功能挽救实验等方法阐明参与Angiogenin调控的可能mi RNA机制;通过对正常患者和PE患者临床样本中Angiogenin等相关因子的相关性分析进一步论证Angiogenin及其相关mi RNA机制在PE发病中的作用。结果本课题研究结果可以分为以下4个部分,具体如下:1.Angiogenin在不同DSCM处理组细胞和临床样本中的表达分析:首先我们对芯片数据进行了q PCR验证,结果发现,与芯片结果一致,使用不同DSCM处理后滋养细胞的侵袭和迁移能力与细胞中Angiogenin的表达明显相关,具有较强侵袭能力的绒毛膜癌细胞JEG-3中Angiogenin表达明显高于正常滋养细胞HTR8/SVneo,子痫前期患者胎盘组织中Angiogenin表达显著低于正常妊娠患者。本部分研究结果提示Angiogenin可能参与了滋养细胞侵袭和迁移功能调控。2.Angiogenin对滋养细胞侵袭和迁移功能的影响:为了证实Angiogenin对滋养细胞功能的影响,我们首先设计并构建了Angiogenin的过表达质粒p CMV-ANG,通过质粒测序和Western blot结果证实其构建成功;使用p CMV-ANG过表达质粒转染滋养细胞系HTR8/SVneo后,通过Transwell实验和划痕实验发现其可以明显促进滋养细胞的侵袭和迁移能力,同时细胞中MMP-2的表达显著增加;使用Angiogenin的si RNA转染HTR8/SVneo发现,通过si RNA降低Angiogenin表达后可以显著抑制滋养细胞的侵袭和迁移能力,同时MMP-2表达减低;为了证实Angiogenin调控与MMP-2的相关性,我们使用MMP-2的si RNA设计了功能挽救实验,结果发现,降低MMP-2表达后可以明显抑制Angiogenin对滋养细胞侵袭和迁移能力的促进作用。本部分研究结果提示,Angiogenin可以促进滋养细胞的侵袭和迁移功能,其调控作用依赖于MMP-2的表达。3.Angiogenin调控滋养细胞功能的mi RNA机制研究:为了进一步研究Angiogenin调控滋养细胞机制,我们对以往文献中mi RNA芯片数据进行生物信息学分析和q PCR验证,结果发现滋养细胞中差异表达的mi R-519d-3p可能参与了其调控;使用mi R-519d-3p mimics和inhibitor转染后的Transwell实验和划痕实验结果发现,mi R-519d-3p可以明显抑制滋养细胞的侵袭和迁移能力;使用mi R-519d-3p mimics和MMP-2 si RNA等进行荧光素酶报告基因实验、q PCR、Western blot实验和功能学挽救实验后证实,MMP-2 3’UTR区域存在一个mi R-519d-3p的结合位点,mi R-519d-3p可以抑制MMP-2的m RNA和蛋白表达,mi R-519d-3p通过抑制其靶基因MMP-2表达进而调控滋养细胞的侵袭和迁移功能;为了明确Angiogenin与mi R-519d-3p的相互调控关系及其在调控功能中的作用,我们对不同Angiogenin处理组中mi R-519d-3p表达谱进行分析,并使用Angiogenin si RNA和mi R-519d-3p inhibitor进行功能学挽救实验,结果发现,Angiogenin可以抑制mi R-519d-3p表达,其可以通过调控下游mi R-519d-3p/MMP-2信号通路进而参与滋养细胞的侵袭和迁移功能调控。4.Angiogenin、mi R-519d-5p和MMP-2在PE临床样本中的表达分析:为了证实Angiogenin/mi R-519d-3p/MMP-2调控通路在临床滋养细胞相关疾病如PE发病中的作用,我们针对正常患者和s PE患者胎盘组织中Angiogenin、mi R-519d-3p和MMP-2表达进行了q PCR检测和Pearson相关系数及线性回归分析。q PCR结果发现,与正常患者相比,s PE患者胎盘中Angiogenin和MMP-2表达明显降低,而mi R-519d-3p表达显著升高;Pearson相关系数及线性回归分析证实,s PE患者胎盘组织中Angiogenin、mi R-519d-3p和MMP-2表达明显相关,提示Angiogenin/mi R-519d-3p/MMP-2调控通路可能参与了临床PE的发病过程。结论通过以上本课题研究结果,我们最终有以下几点发现:1.Angiogenin参与了滋养细胞侵袭和迁移功能的调控,它可以明显促进滋养细胞的侵袭和迁移功能,其作用依赖于调控下游MMP-2表达;2.mi R-519d-3p可以抑制滋养细胞的侵袭和迁移能力,主要依赖于调控靶基因MMP-2而发挥抑制作用;3.Angiogenin通过mi R-519d-3p/MMP-2通路发挥促进滋养细胞侵袭和迁移功能的作用,同时Angiogenin/mi R-519d/MMP-2调控通路可能参与临床PE的发病过程。