Pfu DNA聚合酶来源于古细菌Pyrococcus furiosus,该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50),为多聚体,分子量约为90kDa。该酶同时具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切核酸酶活性,因此在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基,忠实性极高。Sso7d是来源于SuIfolobus solfataricus的一种双链DNA结合蛋白,与DNA聚合酶融合后,聚合酶的进行性得到了显著的提升,而其对聚合酶催化活性和热稳定性没有影响。本研究通过在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达.Pfu DNA聚合酶与Sso7d融合蛋白(pfusso蛋白),成功地开发了Pfu DNA聚合酶表达的新方法。基因被克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A,获取重组质粒。由于该载体含有醇氧化酶启动子,因此异源蛋白在毕赤酵母中的表达能被严谨地调控。然后将重组质粒线性化后电击转化至毕赤酵母GS115菌株,涂布于MD平板,随机挑取转化子,摇瓶培养,加入终浓度为0.5%的甲醇诱导蛋白表达,在不同诱导时间段取培养基上清液进行SDS-PAGE检测。将提取的粗酶液进行酶活性检测。结果表明,本研究成功实现了pfusso在毕赤酵母菌中的分泌性表达。用Bradford蛋白浓度测定方法法测定其表达量约为187mg/L,该酶的扩增性能、扩增产物产量和热稳定性要优于大肠杆菌表达的pfusso,但是扩增产物的忠实性相对较低。本研究利用毕赤酵母成功表达了一种高保真热稳定性DNA聚合酶,节约了高保真DNA聚合酶的生产成本,简化了纯化步骤,为利用毕赤酵母规模化生产热稳定性DNA聚合酶打下了良好基础。