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目的： 1、研究一：通过HBV对HK-2细胞的干预，探讨HBV可通过TGF-β1/Smad通路引起肾小管上皮细胞发生转分化，进而可能引起肾小管间质纤维化的发生； 2、研究二：通过肾疏宁含药血清对HBV诱导的HK-2细胞的干预，探讨肾疏宁通过TGF-β1/Smad通路干预肾小管上皮细胞发生转分化，进而推测肾疏宁可抑制肾小管间质纤维化的进程，对肾小管上皮细胞起到保护作用。 方法： 1、研究一：体外培养HK-2细胞，将扩增、鉴定后的质粒应用脂质体转染法转染至HK-2细胞。根据实验目的，将细胞分为三组，分别为：常规培养的HK-2细胞组（Mock组）；转染空载质粒pHY106的HK-2细胞组（Control组）；转染空质粒与HBV复合物（PHY106-HBV）的HK-2细胞组（HBV组），实验分三个独立样本（n=3）进行检测。HK-2细胞转染48h后，应用ELISA法检测各组细胞裂解液中HBsAg、HBeAg及TGF-β1的表达量；应用Western Blot技术分析转染后Smads蛋白（pSmad2、pSmad3、Smad7）及ILK蛋白的表达；应用qPCR技术检测ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达；应用免疫细胞化学法检测α-SMA、E-cadherin 的表达。所有数据应用 SPSS statistics 24.0及GraphPad Prism 7软件进行统计及作图。 2、研究二：将肾疏宁加工煎煮、过滤后，用旋转蒸发仪浓缩以备用，将肾疏宁分为不同的三组浓度（低、中、高剂量），分别予小鼠灌胃，贝那普利组以等效剂量的贝那普利混悬液灌胃，空白对照组以等剂量的生理盐水灌胃，制备含药血清，并应用MTT法确定肾疏宁的最佳给药浓度。实验分为 8 组：Mock 组、Control 组、HBV 组、HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组，经HBV转染6h后，予各组对应的药物进行干预。药物干预48h后，应用ELISA法检测各组细胞裂解液中HBsAg、HBeAg及TGF-β1的表达量；应用Western Blot技术分析转染后Smads蛋白（pSmad2、pSmad3、Smad7）的表达；应用qPCR检测ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达；应用免疫细胞化学法检测α-SMA、E-cadherin的表达；应用Transwell法检测细胞迁徙能力。所有数据应用SPSS statistics 24.0及GraphPad Prism 7软件进行统计及作图。 结果： 1、研究一： 1）HBV转染HK-2细胞，pHY106-HBV成功表达HBsAg和HBeAg。 HBV转染HK-2细胞48小时后，倒置显微镜下细胞形态发生变化，细胞由圆形或椭圆形铺路石样的生长形态，变大变长，发展为呈多角形、梭形样的形态。ELISA法检测转染后的HK-2细胞，HBsAg的表达显著升高（P＜0.01），HBeAg表达显著升高（P＜0.001）。 2）HBV可通过引起TGF-β1/Smad通路相关的转录因子和信号转导蛋白的变化而干预HK-2细胞转分化的发生。 应用ELISA法检测转染48h后HK-2细胞中TGF-β1的浓度，与Control组比较， HBV 组 TGF-β1 的表达明显升高，差异显著（P＜0.001）；应用 qPCR 检测 TGF-β1 mRNA的表达，与Control组比较，HBV组明显升高，差异显著（P＜0.001）。Western Blot法检测HK-2细胞中Smads蛋白的表达情况，与Control组比较，pSmad2、pSmad3表达均明显上调，差异显著（P＜0.001），而Smad7表达无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。HBV可上调TGF-β1因子的表达，TGF-β1表达升高，导致Smad2、Smad3 蛋白激活，发生磷酸化而发挥信号转导的作用；而 Smad7 作为抑制型 Smad 蛋白，在HBV转染HK-2细胞发生转分化的过程中未发生改变。 3）Western Blot法检测转染后HK-2细胞，与Control组比较，HBV组的ILK蛋白未发生明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。 4）HBV可诱导HK-2细胞发生表型转化 免疫细胞化学法检测α-SMA、E-cadherin 的表达，与 Control 组比较，HBV组α-SMA表达明显增加，胞浆内棕黄色颗粒显著增加，差异显著（P＜0.001）；E-Cadherin表达降低，胞浆内棕黄色颗粒减少，HBV组与Control比较平均光密度值，差异有统计学意义（P＜0.05）。 5）HBV干预HK-2细胞，HK-2细胞发生EMT，细胞外基质成分显著增加。 qPCR法检测ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达，与Control组比较，HBV组ColⅢmRNA、ColⅣ mRNA、FN mRNA的表达均明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。 2、研究二： 1）肾疏宁对HBsAg、HBeAg表达的影响 应用ELISA法检测细胞裂解液中HBsAg的表达情况，与HBV组比较，HBV+SSNLow 组、HBV+SSN Middle 组 HBsAg的表达无明显变化（P＞0.05）；HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN High组HBsAg的表达量减少（P＜0.05）。其余各干预组比较HBsAg的表达量无明显变化（P＞0.05）。 应用ELISA法检测细胞裂解液中HBeAg的表达情况，与HBV组比较，各干预组HBeAg的表达无明显变化（P＞0.05），但肾疏宁高剂量含药血清对HBeAg有一定的抑制趋势。 2）肾疏宁对TGF-β1/Smad通路的影响 ①肾疏宁对TGF-β1因子的影响 应用 ELISA 法检测细胞裂解液中 TGF-β1 的表达情况，与 HBV 组比较，HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+ SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组TGF-β1的表达均有下调（P＜0.001）。与HBV+SB431542组比较，HBV+SSN High组、HBV+ACEI组TGF-β1的表达相对较少（P＜0.01）。与HBV+ACEI组比较， HBV+ SSN Low 组、HBV+SSN Middle 组 TGF-β1 的表达相对较高（P＜0.05）。与HBV+SSN High组比较，HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组TGF-β1的表达相对较多（P＜0.05）。 应用qPCR法检测TGF-β1 mRNA的表达情况，与HBV组比较，HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+ SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组对HBV诱导HK-2转分化过程中TGF-β1基因的表达均有明显的抑制作用（P＜0.01）。各干预组组间比较TGF-β1 mRNA的表达无明显变化（P＞0.05）。 ②肾疏宁对Smads蛋白的影响 应用Western blot法检测pSmad2、pSmad3、Smad7的表达情况，与HBV组比较，HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组，pSmad2、pSmad3蛋白表达均下调（P＜0.05），而Smad7表达未见明显变化（P＞0.05）。余各干预组pSmad2、pSmad3、Smad7表达未见明显变化（P＞0.05）。 3）肾疏宁对HK-2细胞表型转化的影响 免疫细胞化学法检测α-SMA蛋白的表达，与HBV组比较，HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组，α-SMA蛋白表达明显下调（P＜0.001），各治疗组胞质棕黄色颗粒表现为不同程度的减少。与HBV+SB431542组比较，HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组α-SMA蛋白表达相对较少（P＜0.05）；HBV+SSN High组α-SMA蛋白表达明显较少（P＜0.01）；HBV+SSN Middle组α-SMA蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。与HBV+ACEI组比较，HBV+SSN Low组、HBV+SSN High组α-SMA 蛋白表达无明显变化（P＞0.05）；HBV+ SSN Middle组α-SMA蛋白表达相对较多（P＜0.05）。与HBV+SSN High组比较，HBV+SSN Middle组α-SMA蛋白表达相对较多（P＜0.01）。 免疫细胞化学法检测E-cadherin蛋白的表达，与HBV组比较，HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组、HBV+ACEI组、HBV+SB431542组有上调E-cadherin蛋白表达的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。各治疗组较HBV组，其胞浆内棕黄色颗粒均略有增多，但增多不明显。 4）肾疏宁对细胞外基质的影响 应用qPCR法检测细胞外基质中ColⅢ、ColⅣ、FN基因的表达情况，与HBV组比较，HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSNHigh组对HBV诱导HK-2转分化过程中ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达均有明显的抑制作用（P＜0.01）。与HBV+SB431542组比较，HBV+SSN Middle组ColⅣmRNA的表达相对较少（P＜0.01）。与HBV+ACEI组比较，肾疏宁各干预组ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA 的表达无明显变化（P＞0.05）。肾疏宁各干预组组间比较，ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达无明显变化（P＞0.05）。 5）肾疏宁对HK-2细胞迁徙能力的影响 应用 Transwell 法动态观察 EMT 过程中细胞迁徙能力的变化，与 HBV 组比较， HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组细胞迁徙能力均有明显减弱（P＜0.001）。 结论： 1、HBV成功转染HK-2细胞，并表达HBsAg、HBeAg； 2、HBV 通过 TGF-β1/Samd 信号通路诱导 HK-2 细胞发生 EMT，具体表现为： ①HBV转染HK-2细胞，上调TGF-β1因子的表达，导致Smad2、Smad3蛋白激活而发生磷酸化，进而发挥信号转导的作用。 ②HBV可诱导HK-2细胞发生表型转化，上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达下调，而肌成纤维细胞标记蛋白α-SMA表达上调。 ③HBV转染 HK-2 细胞，导致细胞外基质增多，具体表现为基底膜成分ColⅣ mRNA表达上调，间质基质成分ColⅢ mRNA、FN mRNA表达上调。 3、肾疏宁（疏利少阳法）低剂量、中剂量含药血清对HBV-GN肾小管上皮细胞表达的HBsAg、HBeAg作用不明显，肾疏宁高剂量含药血清对HBsAg有下调作用，提示临床治疗HBV-GN中，需联合应用针对HBV和HBV抗原表达的抗病毒药物。 4、肾疏宁（疏利少阳法）可有效防治HBV-GN肾小管间质纤维化，其可能的机制是： ①肾疏宁可干预TGF-β1/Smad信号通路的转导途径而延缓HBV-GN肾小管上皮细胞EMT的发生。肾疏宁可抑制TGF-β1因子的合成及TGF-β1基因的表达；肾疏宁可下调 pSmad2、pSmad3 蛋白的表达。 ②肾疏宁可抑制 HBV-GN 肾小管上皮细胞的表型转化：肾疏宁对成纤维细胞标志蛋白α-SMA蛋白有明显抑制作用，而对上皮细胞标记蛋白E-cadherin蛋白的表达有上调趋势。 ③肾疏宁可抑制细胞外基质成分的合成：肾疏宁可下调ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达。