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目的: 1、研究一:通过HBV对HK-2细胞的干预,探讨HBV可通过TGF-β1/Smad通路引起肾小管上皮细胞发生转分化,进而可能引起肾小管间质纤维化的发生; 2、研究二:通过肾疏宁含药血清对HBV诱导的HK-2细胞的干预,探讨肾疏宁通过TGF-β1/Smad通路干预肾小管上皮细胞发生转分化,进而推测肾疏宁可抑制肾小管间质纤维化的进程,对肾小管上皮细胞起到保护作用。 方法: 1、研究一:体外培养HK-2细胞,将扩增、鉴定后的质粒应用脂质体转染法转染至HK-2细胞。根据实验目的,将细胞分为三组,分别为:常规培养的HK-2细胞组(Mock组);转染空载质粒pHY106的HK-2细胞组(Control组);转染空质粒与HBV复合物(PHY106-HBV)的HK-2细胞组(HBV组),实验分三个独立样本(n=3)进行检测。HK-2细胞转染48h后,应用ELISA法检测各组细胞裂解液中HBsAg、HBeAg及TGF-β1的表达量;应用Western Blot技术分析转染后Smads蛋白(pSmad2、pSmad3、Smad7)及ILK蛋白的表达;应用qPCR技术检测ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达;应用免疫细胞化学法检测α-SMA、E-cadherin 的表达。所有数据应用 SPSS statistics 24.0及GraphPad Prism 7软件进行统计及作图。 2、研究二:将肾疏宁加工煎煮、过滤后,用旋转蒸发仪浓缩以备用,将肾疏宁分为不同的三组浓度(低、中、高剂量),分别予小鼠灌胃,贝那普利组以等效剂量的贝那普利混悬液灌胃,空白对照组以等剂量的生理盐水灌胃,制备含药血清,并应用MTT法确定肾疏宁的最佳给药浓度。实验分为 8 组:Mock 组、Control 组、HBV 组、HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组,经HBV转染6h后,予各组对应的药物进行干预。药物干预48h后,应用ELISA法检测各组细胞裂解液中HBsAg、HBeAg及TGF-β1的表达量;应用Western Blot技术分析转染后Smads蛋白(pSmad2、pSmad3、Smad7)的表达;应用qPCR检测ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达;应用免疫细胞化学法检测α-SMA、E-cadherin的表达;应用Transwell法检测细胞迁徙能力。所有数据应用SPSS statistics 24.0及GraphPad Prism 7软件进行统计及作图。 结果: 1、研究一: 1)HBV转染HK-2细胞,pHY106-HBV成功表达HBsAg和HBeAg。 HBV转染HK-2细胞48小时后,倒置显微镜下细胞形态发生变化,细胞由圆形或椭圆形铺路石样的生长形态,变大变长,发展为呈多角形、梭形样的形态。ELISA法检测转染后的HK-2细胞,HBsAg的表达显著升高(P<0.01),HBeAg表达显著升高(P<0.001)。 2)HBV可通过引起TGF-β1/Smad通路相关的转录因子和信号转导蛋白的变化而干预HK-2细胞转分化的发生。 应用ELISA法检测转染48h后HK-2细胞中TGF-β1的浓度,与Control组比较, HBV 组 TGF-β1 的表达明显升高,差异显著(P<0.001);应用 qPCR 检测 TGF-β1 mRNA的表达,与Control组比较,HBV组明显升高,差异显著(P<0.001)。Western Blot法检测HK-2细胞中Smads蛋白的表达情况,与Control组比较,pSmad2、pSmad3表达均明显上调,差异显著(P<0.001),而Smad7表达无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。HBV可上调TGF-β1因子的表达,TGF-β1表达升高,导致Smad2、Smad3 蛋白激活,发生磷酸化而发挥信号转导的作用;而 Smad7 作为抑制型 Smad 蛋白,在HBV转染HK-2细胞发生转分化的过程中未发生改变。 3)Western Blot法检测转染后HK-2细胞,与Control组比较,HBV组的ILK蛋白未发生明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。 4)HBV可诱导HK-2细胞发生表型转化 免疫细胞化学法检测α-SMA、E-cadherin 的表达,与 Control 组比较,HBV组α-SMA表达明显增加,胞浆内棕黄色颗粒显著增加,差异显著(P<0.001);E-Cadherin表达降低,胞浆内棕黄色颗粒减少,HBV组与Control比较平均光密度值,差异有统计学意义(P<0.05)。 5)HBV干预HK-2细胞,HK-2细胞发生EMT,细胞外基质成分显著增加。 qPCR法检测ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达,与Control组比较,HBV组ColⅢmRNA、ColⅣ mRNA、FN mRNA的表达均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。 2、研究二: 1)肾疏宁对HBsAg、HBeAg表达的影响 应用ELISA法检测细胞裂解液中HBsAg的表达情况,与HBV组比较,HBV+SSNLow 组、HBV+SSN Middle 组 HBsAg的表达无明显变化(P>0.05);HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN High组HBsAg的表达量减少(P<0.05)。其余各干预组比较HBsAg的表达量无明显变化(P>0.05)。 应用ELISA法检测细胞裂解液中HBeAg的表达情况,与HBV组比较,各干预组HBeAg的表达无明显变化(P>0.05),但肾疏宁高剂量含药血清对HBeAg有一定的抑制趋势。 2)肾疏宁对TGF-β1/Smad通路的影响 ①肾疏宁对TGF-β1因子的影响 应用 ELISA 法检测细胞裂解液中 TGF-β1 的表达情况,与 HBV 组比较,HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+ SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组TGF-β1的表达均有下调(P<0.001)。与HBV+SB431542组比较,HBV+SSN High组、HBV+ACEI组TGF-β1的表达相对较少(P<0.01)。与HBV+ACEI组比较, HBV+ SSN Low 组、HBV+SSN Middle 组 TGF-β1 的表达相对较高(P<0.05)。与HBV+SSN High组比较,HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组TGF-β1的表达相对较多(P<0.05)。 应用qPCR法检测TGF-β1 mRNA的表达情况,与HBV组比较,HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+ SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组对HBV诱导HK-2转分化过程中TGF-β1基因的表达均有明显的抑制作用(P<0.01)。各干预组组间比较TGF-β1 mRNA的表达无明显变化(P>0.05)。 ②肾疏宁对Smads蛋白的影响 应用Western blot法检测pSmad2、pSmad3、Smad7的表达情况,与HBV组比较,HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组,pSmad2、pSmad3蛋白表达均下调(P<0.05),而Smad7表达未见明显变化(P>0.05)。余各干预组pSmad2、pSmad3、Smad7表达未见明显变化(P>0.05)。 3)肾疏宁对HK-2细胞表型转化的影响 免疫细胞化学法检测α-SMA蛋白的表达,与HBV组比较,HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组,α-SMA蛋白表达明显下调(P<0.001),各治疗组胞质棕黄色颗粒表现为不同程度的减少。与HBV+SB431542组比较,HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组α-SMA蛋白表达相对较少(P<0.05);HBV+SSN High组α-SMA蛋白表达明显较少(P<0.01);HBV+SSN Middle组α-SMA蛋白表达无明显变化(P>0.05)。与HBV+ACEI组比较,HBV+SSN Low组、HBV+SSN High组α-SMA 蛋白表达无明显变化(P>0.05);HBV+ SSN Middle组α-SMA蛋白表达相对较多(P<0.05)。与HBV+SSN High组比较,HBV+SSN Middle组α-SMA蛋白表达相对较多(P<0.01)。 免疫细胞化学法检测E-cadherin蛋白的表达,与HBV组比较,HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组、HBV+ACEI组、HBV+SB431542组有上调E-cadherin蛋白表达的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。各治疗组较HBV组,其胞浆内棕黄色颗粒均略有增多,但增多不明显。 4)肾疏宁对细胞外基质的影响 应用qPCR法检测细胞外基质中ColⅢ、ColⅣ、FN基因的表达情况,与HBV组比较,HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSNHigh组对HBV诱导HK-2转分化过程中ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达均有明显的抑制作用(P<0.01)。与HBV+SB431542组比较,HBV+SSN Middle组ColⅣmRNA的表达相对较少(P<0.01)。与HBV+ACEI组比较,肾疏宁各干预组ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA 的表达无明显变化(P>0.05)。肾疏宁各干预组组间比较,ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达无明显变化(P>0.05)。 5)肾疏宁对HK-2细胞迁徙能力的影响 应用 Transwell 法动态观察 EMT 过程中细胞迁徙能力的变化,与 HBV 组比较, HBV+SB431542组、HBV+ACEI组、HBV+SSN Low组、HBV+SSN Middle组、HBV+SSN High组细胞迁徙能力均有明显减弱(P<0.001)。 结论: 1、HBV成功转染HK-2细胞,并表达HBsAg、HBeAg; 2、HBV 通过 TGF-β1/Samd 信号通路诱导 HK-2 细胞发生 EMT,具体表现为: ①HBV转染HK-2细胞,上调TGF-β1因子的表达,导致Smad2、Smad3蛋白激活而发生磷酸化,进而发挥信号转导的作用。 ②HBV可诱导HK-2细胞发生表型转化,上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达下调,而肌成纤维细胞标记蛋白α-SMA表达上调。 ③HBV转染 HK-2 细胞,导致细胞外基质增多,具体表现为基底膜成分ColⅣ mRNA表达上调,间质基质成分ColⅢ mRNA、FN mRNA表达上调。 3、肾疏宁(疏利少阳法)低剂量、中剂量含药血清对HBV-GN肾小管上皮细胞表达的HBsAg、HBeAg作用不明显,肾疏宁高剂量含药血清对HBsAg有下调作用,提示临床治疗HBV-GN中,需联合应用针对HBV和HBV抗原表达的抗病毒药物。 4、肾疏宁(疏利少阳法)可有效防治HBV-GN肾小管间质纤维化,其可能的机制是: ①肾疏宁可干预TGF-β1/Smad信号通路的转导途径而延缓HBV-GN肾小管上皮细胞EMT的发生。肾疏宁可抑制TGF-β1因子的合成及TGF-β1基因的表达;肾疏宁可下调 pSmad2、pSmad3 蛋白的表达。 ②肾疏宁可抑制 HBV-GN 肾小管上皮细胞的表型转化:肾疏宁对成纤维细胞标志蛋白α-SMA蛋白有明显抑制作用,而对上皮细胞标记蛋白E-cadherin蛋白的表达有上调趋势。 ③肾疏宁可抑制细胞外基质成分的合成:肾疏宁可下调ColⅢ、ColⅣ、FN mRNA的表达。