论文部分内容阅读
前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性泌尿生殖系统常见恶性肿瘤,预后较差,且容易复发,对男性健康构成严重威胁。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类新型非编码RNA,大量存在于真核细胞中,结构稳定,高度保守,具有一定的组织和细胞特异性。相关研究表明circRNA与多种疾病有关,特别是在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色。但是关于circRNA在前列腺癌中作用机制的研究尚无报道。上皮间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是上皮样细胞向间质细胞形态转变的过程,它在肿瘤的迁移和侵袭过程中发挥着重要作用,但是其相关作用机制尚未研究清楚。CircRNA在EMT调控过程中的作用机制亦不清楚。本研究旨在阐明circAMOTL1在前列腺癌中的作用及其在EMT调控过程中的作用机制,为后续研究提供实验基础。通过对前列腺癌及前列腺增生组织中circRNA的筛选,发现circAMOTL1在前列腺癌组织中表达下调;细胞实验显示,circAMOTL1可以调节EMT标志基因的表达。本研究将对circAMOTL1在前列腺癌中的表达及其在EMT调控过程中的作用机制进行研究,为circRNA在前列腺癌诊治中的应用提供理论基础。目的:阐明circAMOTL1在前列腺癌中的表达及其在EMT调控过程中的作用机制。方法:1收取PCa及前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)临床标本,分别提取组织的RNA,及病理切片进行形态学分析。2设计环状RNA连接处的divergent primers和convergent primers并进行PCR扩增,检测circRNAs在前列腺组织及细胞中的表达,并对表达明显的circRNA进行全长扩增并测序确定序列信息。同时使用circAMOTL1连接处的荧光探针对PCa组织及BPH组织进行荧光原位杂交,检测circAMOTL1的表达差异。3利用正常前列腺上皮细胞RWPE-1细胞和前列腺癌细胞PC3细胞、lncap细胞、du145细胞的rna进行实时定量pcr,用以检测circamotl1在前列腺非癌细胞和癌细胞中的表达差异。细胞分别转染质粒gfp-circamotl1和gfp-ctl,检测两组circamotl1的表达。随后进行transwell实验和创伤愈合实验,检测gfp-circamotl1对细胞迁移和侵袭的影响。4细胞分别转染si-ctl、si-circamotl1和si-linearamotl1,检测circamotl1和amotl1mrna的表达。之后再进行transwell实验和创伤愈合实验来检测si-circamotl1对细胞迁移和侵袭的影响。5pc3细胞过表达或敲低circamotl1,然后在显微镜下观察细胞的形态,同时进行westernblot实验来检测emt标志基因的表达。结果:1检测环状rna在pca组织中的表达。通过rt-pcr,在cdna组能检测到条带而gdna(基因组dna)组检测不到条带表明该环状rna存在,并且能被扩增出来。pcr结果显示,circamotl1表达最明显。随后对circamotl1的全长进行扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳及桑格测序进行鉴定,结果显示,circamotl1全长有1072个碱基,连接处序列与预测的序列一致。2Circamotl1在前列腺癌组织的表达下调。qrt-pcr结果显示,与bph组织相比,circamotl1在pca组织中的表达水平显著降低。荧光原位杂交结果显示,circamotl1探针的荧光强度在pca组织中显著低于bph组织,表明circamotl1在pca组织中表达下调。3Circamotl1过表达能够抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭。在正常及不同的前列腺癌细胞株中检测circamotl1的表达,qrt-pcr结果显示,前列腺癌pc3细胞中的circamotl1表达水平明显低于正常前列腺上皮细胞及其它癌细胞。为了研究circamotl1的功能,构建了circamotl1过表达质粒。在pc3细胞中分别转染质粒gfp-circamotl1和gfp-ctl,提取rna并进行实时定量pcr。结果显示,过表达组的circamotl1表达水平显著高于对照组。该结果说明质粒能够成功在pc3细胞中过表达circamotl1。过表达circamotl1后并进行transwell实验,结果显示,与对照组相比,circamotl1过表达组的细胞迁移数和侵袭数显著减少。创伤愈合实验结果显示,过表达circAMOTL1能够明显降低PC3细胞的迁移能力。上述结果说明过表达circAMOTL1能够抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭。4敲低circAMOTL1能够促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭。PC3细胞分别转染si-Ctl、si-circAMOTL1和si-linear AMOTL1后,提取细胞RNA并反转录,实时定量PCR检测circAMOTL1和AMOTL1mRNA的表达。结果显示,si-linear AMOTL1能降低circAMOTL1和AMOTL1 mRNA的水平,而si-circAMOTL1只能降低circAMOTL1的表达。该结果表明si-circAMOTL1能特异敲低circAMOTL1,而不影响线性AMOTL1的表达。Transwell实验结果显示,circAMOTL1敲低组的细胞迁移数和侵袭数明显高于对照组。创伤愈合实验结果显示,敲低组的细胞迁移能力比对照组强。上述结果说明敲低circAMOTL1能够促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭。5 CircAMOTL1参与调控EMT。普通光学显微镜观察结果显示,circAMOTL1过表达后细胞表现为上皮样细胞形态,而敲低circAMOTL1后细胞表现为间质样细胞形态。Western blot实验结果显示,与对照组相比,过表达circAMOTL1显著上调上皮细胞标志蛋白E-cadherin和Claudin1的表达,而下调间质细胞标志蛋白Vimentin的表达。相反,敲低circAMOTL1后上皮细胞标志蛋白E-cadherin和Claudin1表达下调,间质细胞标志蛋白Vimentin表达上调。而两组的β-catenin的表达水平均无明显变化。结论:1CircAMOTL1存在于前列腺组织中,并在癌变过程中表达下调。2过表达circAMOTL1抑制而敲低circAMOTL1促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭。3CircAMOTL1通过调控EMT标志蛋白的表达在前列腺癌细胞的迁移和侵袭中发挥作用。