布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患细菌性传染病,临床常表现为慢性感染状态,孕畜感染后主要发生流产和死胎。该病是影响畜牧业的可持续发展的重要疫病,对其防控必须依赖严格的生物安全措施,临床监测和疫苗接种均是其中的重要手段。本研究在2018—2019年间采集了江苏部分地区25个自繁自养羊场共2500份血清样品,通过虎红平板凝集试验进行了检测。结果表明江苏自繁自养羊场无布鲁菌病阳性病例。但在大交通、大流通的背景下仍要加强防范意识,避免因引种等导致布鲁菌病局部流行。由于当期动物布鲁菌病疫苗存在一定的残余毒力,因此该研究在前期发现与布鲁菌毒力相关的2个转录调控元件ArsR6和GntR4的基础上,通过基因定向缺失方法,成功构建了带有卡那霉素抗性标记的流产布鲁菌arsR6基因缺失株和无痕的gntR4基因缺失株,并进一步对其脂多糖（LPS）表型、耐受性、Ⅳ型分泌系统（T4SS）以及对巨噬细胞和小鼠的感染性进行了测定,分析了其作为候选疫苗的可能性。LPS表型分析发现,缺失株ΔarsR6的LPS完整,为光滑型菌株。耐受性试验分析发现,其与亲本株相比,减弱了对阳性杀菌肽多黏菌素B的抵抗性,对过氧化氢的耐受性无差异。通过免疫印迹分析发现,ArsR6对布鲁菌的T4SS的表达呈现抑制作用。细胞感染试验发现,缺失株ΔarsR6在巨噬细胞内存活的能力增强;当回复表达arsR6基因后,其胞内存活水平回复至亲本株水平。小鼠感染试验发现,缺失株ΔarsR6在感染小鼠的脾脏中的载量要显著高于亲本株,且诱导脾脏肿大能力要显著高于亲本株,回复株的脾脏载菌量和致脾脏肿大的能力有一定水平的回复。以上试验结果表明,ArsR6的确与布鲁菌的毒力相关,推测可能与布鲁菌抵抗阳性杀菌肽杀伤和抑制细菌激活宿主炎性反应相关。LPS表型分析发现,缺失株ΔgntR4为光滑型菌株。耐受性试验发现,其与亲本株相比,对多黏菌素B的耐受性显著降低,而对过氧化氢的耐受性无差异。免疫印迹分析发现,GntR4不影响布鲁菌T4SS的表达。此外,细胞感染试验发现,gntR4基因缺失不影响布鲁菌在巨噬细胞内的存活。小鼠感染试验发现,gntR4基因缺失不影响布鲁菌在小鼠脾脏中的菌载量和致脾脏肿大的能力。以上结果表明,GntR4可能调控部分基因帮助布鲁菌抵抗宿主非特异性免疫杀伤,但GntR4对布鲁菌的胞内存活和小鼠致病性影响不大。综上所述,本研究成功采用了基因有痕和无痕缺失技术构建了布鲁菌arsR6和gntR4基因缺失株,并评估了其生物学特性和感染特性,尽管ArsR6和GntR4与布鲁菌毒力表型存在一定联系,但其单基因缺失株毒力衰减并不明显,不适合直接作为疫苗菌株,而更适合在已有布鲁菌疫苗的基础上,进一步减弱现有疫苗的残余毒力。