论文部分内容阅读
目的哮喘是一种以气道炎症、气道阻塞和粘液分泌过多为特征的过敏性疾病,涉及多种炎性细胞和细胞组分。反复的慢性炎症容易导致哮喘患者发生气道重塑。气道重塑是支气管哮喘发展过程中的关键病理变化,是其反复发作、迁延难愈的重要因素之一。气道重塑的形成的过程当中,在各种诱导因素的作用下,成纤维细胞向肌成纤维细胞转化（fibroblastto-myofibroblast transition,FMT）是气道重构过程的关键步骤。分化形成的肌成纤维细胞会产生大量的α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）,如纤维连接蛋白和胶原蛋白I、III和IV（collagen Ⅰ,III,IV）等。鸢尾素（irisin）是一种小分子的多肽激素,机体运动后由骨骼肌等组织分泌,随血液循环运行到机体各处。研究表明,irisin在多种疾病中能够发挥强大的抗炎、抗氧化应激以及抗凋亡的作用。同时,也有许多研究显示irisin在心脏、肾脏、肝脏和胰腺的纤维化中能够起到潜在保护作用。与哮喘气道重塑类似,纤维化疾病的关键步骤也是成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。然而,暂未看到有关irisin在肺组织中抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的报道。在本实验中,我们以转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）体外诱导,培养人胚肺成纤维细胞（HFL-1）,研究irisin能否在HFL-1细胞表型转化中的发挥作用,并探索可能涉及的分子机制,为哮喘气道重塑的治疗寻找新的可能药物并提供理论依据。方法体外培养人胚肺成纤维细胞HFL-1,用10ng/ml TGF-β1诱导HFL-1细胞,同时,用不同浓度的irisin（25,50,100,200）ng/ml干预细胞24、48及72h。利用CCK8试剂盒检测细胞增殖率。随后,将细胞分为空白对照组（NC组）、TGF-β1组（10ng/ml TGF-β1）、TGF-β1+irisin组（10ng/ml TGF-β1和100ng/ml irisin）。采用细胞划痕实验检测不同组细胞的迁移能力。通过免疫荧光法检测不同处理组细胞α-SMA的表达情况。Western blot法检测不同处理组细胞α-SMA、collagen Ⅰ、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3的蛋白表达水平。结果（1）CCK8实验结果显示:相同作用时间的情况下,与NC组相比,TGF-β1组细胞增殖率显著上升（P＜0.05）;与TGF-β1组相比,随着irisin药物浓度的增加,irisin+TGF-β1各组细胞的增殖率逐渐下降（P＜0.05）。当irisin浓度为100ng/ml时,irisin对HFL-1细胞的增殖抑制作用最显著。相同药物浓度的情况下,在TGF-β1的诱导下,100ng/ml的irisin和的HFL-1细胞共同培育24、48、72h后,irisin的增殖抑制效果随时间的增加逐渐增强,结合细胞生长状态,选用48h作为后续实验时间。（2）细胞划痕实验结果显示:与NC组相比,TGF-β1能够有效促进HFL-1细胞的迁移（P＜0.01）;与TGF-β1组相比,在irisin的干预下,HFL-1细胞的迁移受到明显抑制（P＜0.05）。（3）免疫荧光结果显示:与NC组相比,α-SMA在TGF-β1组中的荧光强度显著提高（P＜0.001）;与TGF-β1组相比,在irisin的干预下,HFL-1细胞α-SMA的荧光强度下降（P＜0.01）。（4）Western blot结果显示:与NC组相比,TGF-β1组中的a-SMA、collagen Ⅰ蛋白的表达水平升高（P＜0.001）,p-Smad2、p-Smad3的表达水平也升高（P＜0.001）;与TGF-β1组相比,在irisin的干预下,HFL-1细胞中a-SMA、collagen Ⅰ的蛋白表达水平下降（P＜0.05）,p-Smad2、p-Smad3的表达水平也下降（P＜0.01）。结论Irisin能够抑制TGF-β1诱导的HFL-1细胞增殖、迁移及向肌成纤维细胞转化,其发挥作用的机制可能与TGF-β/Smad2/3信号通路有关。