研究背景：急性白血病是最常见的恶性肿瘤之一,以疾病发展迅速,骨髓和(或)外周血中存在大量停留在较早期阶段的原始细胞及早期幼稚细胞为特点,包括急性髓细胞白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。在成人急性白血病中,又以AML最为常见。AML一旦发生,原始细胞和幼稚细胞在骨髓及其他造血器官中大量增生累积,干扰骨髓正常造血功能,导致致命性感染、出血和器官浸润,自然病程仅为数周到数月。AML病因未明,一般认为与环境污染、射线、药物等因素有关。目前AML治疗仍以化疗为主(急性早幼粒细胞白血病除外),初始治疗的标准诱导化疗方案可以使完全缓解(Complete Remission, CR)率达60%～80%以上。然而,只有20%～30%的患者能够获得长期无病生存,超过50%的患者仍终将复发,一旦复发,死亡率显著增加。急性白血病患者的5年生存率在中青年患者中只有40%,老年患者则低于10%。复发、难治和老年白血病是目前急性白血病治疗的主要问题。随着分子生物学技术的发展和AML发病机制的逐步阐明,发现了一批与AML发生和发展密切相关的基因并研发了许多针对明确致癌基因或位点的药物,在细胞水平上攻击白血病细胞,如单克隆抗体,酪氨酸激酶抑制剂,法尼基转移酶抑制剂,去甲基化药物,组蛋白去乙酰化酶等。FLT3(Fms-like tyrosine kinase3, CD135)属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase Ⅲ, RTK Ⅲ)家族成员,研究证实FLT3的激活突变在AML的发生及疾病的进展中起重要的作用,是临床预后差的主要指标之一。索拉非尼(Sorafenib);通过抑制具有FLT3-ITD(FLT3内部串联重复)突变的白血病细胞的激酶的活化,造成细胞周期停滞、凋亡,抑制细胞增殖,接受索拉非尼治疗前后外周血原始细胞和骨髓原始细胞比例均下降(分别为7.5%～81%和34%～75.5%)。急性早幼粒细胞白血病(APL)是人类急性白血病分子靶向治疗取得临床治愈的成功范例。全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷直接靶向PML-RAR癌蛋白,诱导白血病细胞分化和凋亡,发挥特异性抗肿瘤作用。难治性和复发白血病的主要原因是白血病细胞对化疗药物产生耐受。P-gp蛋白是由多药耐药基因MDR1(ABCB1)编码的依赖ATP的膜转运蛋白。P-gp由ATP供能,使细胞内药物泵出细胞外,减低了细胞内的药物浓度使细胞产生耐药性。研究显示在AML患者中MDR1高表达与白血病耐药相关,是预后不良的因素,通过下调MDRl表达水平来逆转白血病耐药是改善白血病患者预后的重要策略。因此,面对急性白血病日益增高的发病率以及以分子靶向治疗和分层治疗的成功,阐明AML新的发病机制特别是针对急性白血病特异性分子改变进行有力的干预,对于改善治疗效果十分重要。表皮生长因子受体通路底物8(Epidermal growth factor receptor pathway substrate8,Eps8)是一个分子量为97KDa的蛋白,是多种酪氨酸激酶的磷酸化底物。Eps8蛋白具有典型的信号分子的结构,从N端至C端分别为磷酸化酪氨酸结合区(PTB),SH3区和“效应区”。研究证实Eps8磷酸化水平增加可促进细胞增殖、迁移及转化。目前已发现Eps8在众多实体肿瘤高表达,并与肿瘤侵袭及预后不良有关。在一个对205例口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者长达7年的随访中,发现其中186例存在Eps8持续表达,Eps8持续表达组5年总生存率为43%,而阴性组为74%,差别有统计学意义。在一个45例宫颈癌患者的研究中,Eps8表达水平与宫旁浸润、淋巴结转移和无病生存期缩短呈正相关。同时,下调Eps8水平增加宫颈癌细胞对化学药物的敏感性。在胶质母细胞瘤中,Eps8被证明是促进肿瘤细胞迁移和侵袭的关键分子,通过RNA干扰的方式沉默Eps8基因使肿瘤细胞的侵袭能力显著下降,提示Eps8是潜在的药物治疗的靶点[13]。然而,有关Eps8在恶性血液疾病特别是AML中的作用仍未清楚。在一个97例儿童急性淋巴细胞白血病的临床研究中,基因芯片分析提示Eps8与无病生存率(eventfree survival,EFS)相关,是预后不良的因素。混合谱系白血病(mixed lineage leukemia, MLL)基因重排是儿童白血病中常见的基因异常改变。在许多由易位突变导致的儿童白血病中,含有MLL基因的染色体在MLL内部断裂并融合成不同的基因。其中,MLL-ABI-1(e3B1)是常见的融合基因,其形成使正常e3B1蛋白功能(抑制细胞增殖)丧失,而e3B1是Eps8的下游靶点,因此推断Eps8可能通过MLL-ABI-1融合基因参与了MLL的发病。我们假设Eps8在AML的发生发展中一样起重要作用。在本实验中,我们对Eps8基因进行扩增并导入到pMD18-T载体中构建pMD18-T/Eps8质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,建立荧光定量PCR检测Eps8基因的体系并检测AML患者和健康志愿者中Eps8基因的表达水平。同时,我们应用Western blot分析Eps8在恶性血液病细胞株的表达。最后,构建Eps8-shRNA慢病毒载体,感染急性髓细胞白血病细胞株KG1a,进一步研究Eps8在急性髓细胞白血病中的作用。目的1、建立检测Eps8基因的荧光定量PCR方法。2、检测AML患者及健康志愿者中Eps8基因的表达水平并分析其临床意义。3、分析Eps8在恶性血液疾病细胞株中的表达。4、构建Eps8-shRNA慢病毒载体并感染急性髓细胞白血病细胞株KG1a,构建稳定沉默Eps8基因的急性髓细胞白血病细胞株。方法：1、培养KG1a细胞,提取总RNA,对Eps8基因进行扩增并导入到pMD18-T载体中构建pMD18-T/Eps8质粒载体并作为荧光定量PCR检测的标准模板,GAPDH作为内参照。2、将定量标准模板pMD18-T/Eps8和pMD18-T/GAPDH按10倍倍比稀释进行荧光定量PCR反应得到标准曲线。采用SYBR Green法得到熔解曲线分析引物的特异性。将质粒按梯度稀释(107、106、105、104、103、102copies/μL)作为模板,分别进行荧光定量PCR扩增和常规PCR扩增,对两者灵敏度进行比较。对同一批次提取的质粒按梯度稀释(107、106、105、104、103copies/μL)进行扩增,日内重复3管,不同日期重复检测6次分析该检测方法的重复性。3、通过荧光定量PCR对AML患者及健康志愿者骨髓单个核细胞(BMMNCs)的cDNA进行扩增,通过标准曲线计算得到Eps8跟GAPDH基因的拷贝数并分析Eps8基因的表达水平。4、Western blot分析Eps8在恶性血液病细胞株的表达。5、使用Agel和EcoRI双酶切,将针对Eps8的DNA片段连入带有绿色荧光蛋白和hU6启动子的慢病毒转移质粒,采用脂质体法进行转染转染293T细胞,48小时后收集上清并测定病毒滴度。将慢病毒颗粒按感染复数(multiplicity of infection,MOI)为100感染KG1a细胞,24小时后移除含病毒颗粒培养基,更换新鲜培养基,以嘌呤霉素2μg/ml筛选稳定沉默Eps8的KG1a细胞株并通过Western blot检测干扰效率。结果1、利用Trizol提取的KG1a细胞、AML患者、健康志愿者的总RNA,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见28S和18S和5S3条完整条带,证明抽提的RNA质量好。RT-PCR扩增后终产物经琼脂糖凝胶电泳可看到与目的片段大小一致的96bp(Eps8)、143bp(GAPDH)电泳条带。重组质粒经基因测序证实Eps8及GAPDH基因片段成功克隆到载体中。2、pMD18-T/Eps8和pMD18-T/GAPDH标准曲线Ct值分别在19.389至35.857(102至107拷贝)循环,18.736到35.418(102至107拷贝)循环有良好的线性范围,相关系数为分别为0.999和0.999。SYBR Green法熔解曲线均为单峰,提示扩增特异性高。日内变异(intra-assay)系数(coefficient of variation, CV)为0.83%～1.67%,日间变异(inter-assay)系数为0.54%～3.80%,重复性好。荧光定量PCR在Eps8和GAPDH基因的拷贝数为100时可以检测到特异的扩增曲线,而常规PCR的检测下限为103拷贝数,该荧光定量PCR方法检测Eps8基因的敏感性为常规PCR的10倍。3、AML患者Eps8基因表达水平显著高于健康志愿者。4、急性髓细胞白血病患者Eps8基因表达水平与白细胞、血小板、血红蛋白计数,是否存在肝脾肿大无相关性。Eps8基因高表达组(Eps8基因表达大于或等于5倍)初次化疗完全缓解率低于Eps8基因低表达组(Eps8基因表达低于5倍)。5、对5株恶性血液细胞株Eps8蛋白水平进行分析,以MCF-7(人乳腺癌细胞株)为阳性对照,Eps8在KGla(人急性髓细胞白血病细胞株)、Raji(人淋巴瘤细胞株)、K562(人慢性粒细胞白血病细胞株)表达,在HL-60(人早幼粒白血病细胞株)、8662(人多发性骨髓瘤细胞株)、健康志愿者骨髓单个核细胞不表达,表达水平分析提示Eps8在KGla高表达。6、慢病毒包装并能成功感染包装293T细胞,在感染复数(multiplicity of infection, MOI)为100的含polybrene为5μg/ml的感染增强溶液(Enhanced Infection Solution, ENi.S.)中,荧光显微镜下观察Eps8-shRNA慢病毒转染效率达85%。Western blot检测显示,Eps8-shRNA慢病毒感染后KG1a细胞使Eps8蛋白表达量下降80%。结论1、成功建立检测Eps8基因表达的荧光定量PCR方法。2、AML患者Eps8基因表达水平显著高于健康志愿者。3、AML患者Eps8基因高表达组(Eps8基因表达大于或等于5倍)初次化疗CR率低于Eps8基因低表达组(Eps8基因表达低于5倍)。4、Eps8在急性髓白血病细胞株KGla高表达。5、成功建立稳定沉默Eps8基因急性髓细胞白血病细胞株KGla。