当归多糖是中药当归的主要生物活性成分，在抗贫血、抗肿瘤、肝损伤、免疫作用等方面具有显著活性。本实验以岷县当归饮片为原料，采用水提、酸碱除蛋白的方法提取当归饮片中的当归总多糖，再经醇沉、超滤分级分离和葡聚糖凝胶G50分离纯化得到精制当归多糖组分，命名为ASP1；当归多糖ASP1经异硫氰酸荧光素（FITC）标记，成为可发射荧光的物质，在此基础上对当归多糖ASP1体内外特异性肝靶向作用进行研究。第一部分当归多糖ASP1的提取、分离和纯化以岷县当归饮片为原料，采用水提、酸碱除蛋白的方法提取当归饮片中的当归总多糖，经醇沉、超滤分级分离除掉小分子色素和寡糖等杂质，再经葡聚糖凝胶G50进一步分离纯化得到精制当归多糖组分，命名为ASP1。通过测定ASP1糖含量、相对分子质量，以及进行碘-碘化钾实验和紫外扫描鉴定纯度。经苯酚-硫酸法测得ASP1糖含量为90.8%，高效凝胶色谱法测得其相对分子质量为8.780×104Da，碘-碘化钾实验及紫外扫描图谱显示ASP1不含淀粉、蛋白质和核酸。结果表明，本实验制备得到分子量均一、纯度高的当归多糖ASP1组分。第二部分当归多糖ASP1的荧光标记、产物分析及生物样品中的稳定性考察当归多糖ASP1进行FITC荧光标记，标记产率为83%。采用紫外可见光谱法、荧光光谱法和高效凝胶渗透色谱法考察ASP1荧光标记效率。紫外可见光谱分析结果显示，ASP1标记产物在494nm附近出现特征吸收峰，而未标记的ASP1不具有此特征吸收峰，紫外可见分光光度法测定其FITC的取代度为1.18%（w/w）。荧光光谱分析结果显示，ASP1标记产物有较强的荧光强度，其λex=494nm，λem=520nm。经高效凝胶渗透色谱分析，ASP1标记产物的相对分子质量为8.870×104Da，标记前后ASP1分子量未发生明显变化，表明荧光标记对ASP1结构影响较小。本实验采用高效凝胶渗透色谱荧光检测法测定ASP1标记产物加入生物样品前后的分子量和荧光强度，考察ASP1标记产物在0.01M PBS溶液、体外血浆样品和体内血浆样品中的稳定性。结果显示，在0.01M PBS溶液和体外血浆样品中，ASP1标记产物的分子量和荧光强度于避光37℃，60rpm孵育条件下20h内均未发生明显改变；大鼠尾静脉给药2h后取血样测定标记产物分子量，其分子量未发生改变，表明ASP1在生物样品中的稳定性良好。本实验制备的ASP1标记产物产率高、取代度适宜、荧光强度较高、稳定性良好，适用于后续当归多糖ASP1体内外特异性肝靶向研究。第三部分当归多糖ASP1的体内肝靶向性研究1.生物样品中ASP1含量测定方法的建立利用ASP1标记产物可发射荧光的性质，本实验建立了高效液相色谱荧光检测法测定生物样品中ASP1含量的方法。该方法经方法学确证，ASP1在各生物样品中的定量下限为0.20μg/mL，在0.25~20.00μg/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，r2﹥0.999。测定0.5μg/mL、2.5μg/mL和25.0μg/mL三种不同浓度下样品的回收率和精密度，测得回收率在91.98%~114.20%之间，精密度相对标准偏差符合要求。样品在4℃避光条件下放置3天、-20℃避光条件下放置7天稳定性良好。该方法样品用量少、灵敏度高、特异性强、精密度和重现性较好，适用于药代动力学和组织分布实验大量样本的检测。该方法的建立为研究当归多糖ASP1在大鼠体内的药代动力学和组织分布奠定了方法学基础。2.ASP1在大鼠体内的药代动力学和组织分布研究测定12mg/kg剂量的ASP1经尾静脉给药后在SD大鼠体内的药物浓度-时间数据，采用DAS2.1.1版软件拟合房室模型并计算出药动学参数，得出ASP1在大鼠体内的最佳模型为两室模型，ASP1的t1/2=15.931min， CL=0.001L/min/kg， MRT（0-）=23.536min。参考ASP1的药时曲线和药代动力学参数，确定ASP1尾静脉给药后在大鼠体内的组织分布取样时间点为30min、60min和120min。组织分布结果显示，给药后除肝脏中ASP1浓度大幅升高外，其它组织中ASP1浓度均较低。给药120min后，血液中ASP1浓度降至Cmax的1/60以下，此时ASP1在血液和各组织中浓度由高到低依次为肝血液＞肠＞心＞脾＞肺＞胃＞肾＞脑，肝脏中ASP1的浓度高出其它组织中浓度的30倍以上，充分说明ASP1具有很强的特异性肝靶向作用。本课题组研究结果表明当归多糖ASP1的粒径范围为0.6~1.2μm，在肝和脾的被动靶向粒径范围内。给药后，ASP1浓集于肝脏而在脾脏中的浓度很低，且多数研究表明肝脏和脾脏对于同一药物的被动靶向作用较为相近，由此可初步推断ASP1对肝的被动靶向作用较弱，主动靶向作用占主导地位。3ASP1体内肝靶向的肝组织切片观察大鼠尾静脉注射120mg/kg剂量的ASP1作为实验组，注射生理盐水作为阴性对照组，120min后处死大鼠并制备肝脏组织切片，激光共聚焦显微观察结果显示，实验组肝脏切片的荧光强度明显高于阴性对照组，且实验组肝脏切片中大部分ASP1进入到肝细胞胞浆，细胞间质分布较少，表明ASP1经肝细胞胞吞进入细胞内，由此进一步证实了ASP1具有很好的主动肝靶向作用。第四部分当归多糖ASP1的体外肝靶向性研究采用原位胶原酶灌流法提取大鼠原代肝细胞，构建当归多糖ASP1体外特异性肝靶向研究模型。该方法提取得到的肝细胞活力高于90%，其中肝实质细胞所占比例较大。向大鼠原代肝细胞（1×106）中分别加入50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL浓度梯度的ASP1标记产物作为实验组，加入空白培养基作为阴性对照组，共培养2h后进行流式细胞仪检测。结果显示，实验组原代细胞的荧光强度在加入ASP1标记产物后发生显著改变（与阴性对照组相比，*p﹤0.05），且细胞荧光强度随ASP1浓度递增而加强。与阴性对照组相比，实验组原代肝细胞中荧光强度增加的细胞数目占总体细胞数目的比例（即靶向率）随着ASP1浓度递增而加大，50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL剂量组的靶向率分别为73.93%、94.83%和98.23%。当归多糖ASP1的体外肝靶向研究也证实了ASP1对肝细胞有很强的主动靶向作用。