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研究背景胃癌是目前发病率最高的恶性消化系统肿瘤,胃癌起病隐匿,早期经常缺乏特异性的症状,体征以及早期诊断的指标,因此在全世界尤其是发展中国家以及欠发达国家或地区,尤其是当地人群缺乏定期体检意识的情况下,胃癌常常被误诊为消化性溃疡,慢性胃炎,克罗恩病等其他消化系统疾病,从而延误胃癌治疗的重要时机。本课题组长期致力于研究膜铆钉重复序列蛋白6Ankrd6(diversin)对肿瘤进展的调控作用及其分子机制。我们前期通过免疫组织化学染色发现Diversin在胃癌组织中高表达,并与肿瘤直径,TNM分期,局部淋巴结转移等临床病理因素相关。上述实验结果提示Diversin在胃癌进展过程中可能发挥重要调控作用,其具体作用机制尚需进一步深入研究。现有研究证实Diversin的蛋白中心结构域可以结合多种信号分子以及信号通路关键蛋白,进而调控肿瘤进展过程。蛋白的翻译后修饰可以影响超过半数的蛋白的功能,研究表明蛋白的唾液酸化在多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要调控作用。我们的预实验结果显示Diversin可上调胃癌HGC27细胞中NF-κB的表达水平,生物信息学预测结果显示α2,6唾液酸转移酶ST6GalI基因转录起始点上游2000bp范围的启动子序列中富含NF-κB的结合位点,这一结果提示Diversin很可能通过NF-κB调控胃癌细胞的α2,6唾液酸化进而促进胃癌细胞的恶性生物学行为。实验方法我们构建了携带新霉素抗性Diversin过表达质粒DiversinGV326与携带嘌呤霉素的Diversin shRNA干扰质粒GV248。为了获得转染效率更为稳定的细胞系,我们通过药物浓度梯度实验分别确定了胃未分化癌细胞株HGC27和胃中分化癌细胞株MNK45在G418和嘌呤霉素中适宜的筛选浓度,利用上述质粒转染HGC27细胞及MNK45细胞并通过G418筛选Diversin稳定过表达的细胞,通过嘌呤霉素筛选Diversin稳定下调的胃癌细胞系,然后利用western blot实验对Diversin蛋白上调和下调的效果进行验证。利用MTS细胞增殖实验对Diversin调控胃癌细胞增殖能力的作用进行检测,利用transwell实验对Diversin调控胃癌细胞浸润侵袭能力的作用进行检测,利用划痕试验对Diversin调控胃癌细胞迁移能力进行检测。预实验结果显示Diversin可上调HGC27细胞中NF-κB的表达水平,生物信息学分析表明α2,6唾液酸转移酶(alpha-2-6 sialyl transferase 1,ST6GalI)基因转录起始点上游2000bp范围的启动子序列富含内含有多个可能的NF-κB潜在的结合位点,为了进一步探讨Diversin是否通过NF-κB调控胃癌的进展过程,我们构建了含有ST6GalI基因转录起始点-2000bp范围启动子序列的荧光素酶报告基因质粒,并且与Diversin过表达质粒共转染至胃癌细胞中,检测Diversin是否调控ST6GalI基因转录活性,同时利用realtime PCR及western blot分别检测ST6GalI的mRNA和蛋白表达水平变化加以验证,利用凝集素印迹试验对Diversin调控胃癌细胞α2,6唾液酸化化水平进行检测。实验结果MTS细胞增殖实验克隆形成试验结果显示Diversin可以上调胃未分化癌细胞HGC27细胞和胃中分化癌细胞MNK45细胞的增殖能力;Transwell和划痕实验结果显示Diversin可上调胃未分化癌细胞HGC27细胞和胃中分化癌细胞MNK45细胞的侵袭转移能力。Diversin可上调HGC27细胞ST6GalI基因的转录活性,增加其蛋白表达水平,进而上调HGC27细胞蛋白组α2,6唾液酸化水平。实验结论Diversin可增加胃癌细胞增殖、侵袭及转移能力;Diversin可能通过NF-κB上调HGC27细胞ST6GalI转录活性,增加其mRNA和蛋白表达,进而提高细胞蛋白组α2,6唾液酸化水平。