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目的:分析PIK3CA基因在鼻咽癌组织中表达差异及表观遗传学甲基化水平,阐述鼻咽癌组织中PIK3CA表达与鼻咽癌临床恶性表型、预后的关系;探讨PIK3CA表达模式对于鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响。在此基础上进一步探究PIK3CA上游调控PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和放疗抵抗的作用及其内在调控机制,为揭示鼻咽癌发生发展及放疗抵抗分子机制和个体化治疗靶点的筛选奠定科学基础。方法:第一部分:(1)组织水平,利用免疫组织化学SP染色法检测鼻咽癌及鼻咽正常粘膜组织标本PIK3CA表达水平差异,并分析鼻咽癌组织内PIK3CA表达水平与临床病理参数间的相关性,采用Kaplan-Meier法分析PIK3CA表达水平对鼻咽癌预后的影响;(2)体外细胞水平通过特异性si RNA转染鼻咽癌细胞下调PIK3CA表达,检测PIK3CA表达水平对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移等细胞功能的影响;(3)利用焦磷酸盐测序法检测鼻咽癌及正常鼻咽粘膜组织中PIK3CA基因启动子区甲基化水平差异。第二部分:(1)利用star Base生物信息学分析预测PIK3CA和mi R-515-5p之间的潜在靶位点,构建载有mi R-515-5p结合位点PIK3CA 3’UTR的野生型序列插入p GL3载体,采用双荧光素酶报告基因验证mi R-515-5p调控PIK3CA基因表达结合位点,并通过抗Ago2进行RIP检测并分析mi R-515-5p与PIK3CA的相互作用。(2)组织水平利用q RT-PCR法检测鼻咽癌和正常鼻咽粘膜组织中PIK3CA的m RNA表达水平,并在细胞水平采用western blot法分析PIK3CA基因在鼻咽癌细胞系及正常鼻咽粘膜细胞系中蛋白表达差异;并采用western blot法分析mi R-515-5p敲减后的NPC细胞中PIK3CA蛋白表达调控。(3)用CCK8法检测转染PIK3CA+mi R-515-5p的NPC细胞监测细胞增殖趋势。采用细胞克隆形成实验及流式细胞仪分析不同辐照剂量(0、2、4、6、8 Gy)下转染PIK3CA+mi R-515-5p的NPC细胞相较PIK3CA的存活分数及凋亡情况,并通过western blot法检测不同辐照剂量(0和8Gy)下以上两种细胞的细胞周期蛋白D1和Bax的蛋白水平,从而揭示mi R-515-5p调控PIK3CA对鼻咽癌细胞放疗抵抗水平影响。第三部分:(1)组织水平采用q RT-PCR检测NPC和正常组织中PVT1的表达及不同TNM分期的PVT1表达差异,并分析其表达与预后相关性;细胞水平采用q RT-PCR检测正常粘膜细胞系和NPC细胞系中的PVT1水平差异。(2)采用携带sh RNA的慢病毒转染敲减PVT1,通过q RT-PCR验证PVT1的敲减效率;使用CCK8法评估PVT1表达对细胞增殖水平影响。进行细胞克隆形成能力检测、细胞周期蛋白检测、流式细胞仪检测及western blot法,分析鼻咽癌细胞在不同辐照剂量(0,2,4,6,8Gy)下的存活分数、凋亡情况及细胞周期蛋白水平。(3)用star Base预测了PVT1与mi R-515-5p结合位点;采用双荧光素酶报告基因和抗Ago2法进行混合靶点阳性候选基因的单靶点验证。构建慢病毒载体,采用q RT-PCR评估NPC组织和细胞中转染mi R-515-5p和PVT1表达调控关系。(4)采用CCK8法检测转染mi R-515-5p、mi R-515-5p+PVT1的鼻咽癌细胞增殖情况,采用细胞克隆形成实验及流式细胞仪分析不同辐照剂量下(0、2、4、6、8 Gy)转染PVT1+mi R-515-5p的NPC细胞相较PIK3CA的存活分数及凋亡情况,并通过western blot法检测不同辐照剂量下(0和8 Gy),以上两种细胞的细胞周期蛋白D1和Bax的蛋白水平,从而揭示PVI1调控mi R-515-5p对鼻咽癌细胞放疗抵抗水平影响。(5)通过western blot检测转染sh-PVT1、sh-PVT1+Anti-mi R-515-5p的鼻咽癌中PIK3CA、AKT和p-AKT的蛋白质水平,确定PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴调节关系。(6)为了验证PVT1在体内的功能,通过转染sh-PVT1或sh-Control的C666-1细胞建立异种移植小鼠模型,动态监测瘤体在裸鼠皮下成瘤及生长情况,验证PVT1对鼻咽癌细胞在体内生长的影响。结果:第一部分:(1)PIK3CA蛋白在71例鼻咽癌组织中的表达率为81.69%,高于正常鼻咽粘膜组织31.25%,差异具有统计学意义;PIK3CA在鼻咽癌中的表达与鼻咽癌患者的性别、年龄、病理类型、Ki-67等均无统计学相关性,与肿瘤T分期(P=0.000)、N分期(P=0.008)及临床分期(P=0.002)有相关性,经Kaplan-Meier生存曲线分析发现PIK3CA蛋白强表达的鼻咽癌患者的生存率低于低表达及中等表达的患者(Log Rank检验结果:?~2=7.995,P<0.05);(2)敲减PIK3CA的si RNA转染鼻咽癌细胞后,MTT实验显示鼻咽癌细胞的增殖活性受抑制;细胞划痕和transwell小室实验显示,CNE1细胞的迁移和侵袭能力在敲减PIK3CA后受到了的抑制(P<0.05)。(3)焦磷酸盐测序检测PIK3CA基因启动子甲基化水平,在启动子区发现4个甲基化位点,其中3个位点鼻咽癌组甲基化水平高于正常鼻咽粘膜组织组(P<0.05)。第二部分:(1)利用star Base预测mi R-515-5p和PIK3CA之间的潜在靶位点,双荧光素酶报告基因和RIP检测证实了mi R-515-5p是通过该结合位点调控鼻咽癌细胞中PIK3CA基因的表达;使用western blot法分析其调控关系,结果显示转染mi R-515-5p的鼻咽癌细胞较正常鼻咽粘膜细胞中PIK3CA的蛋白水平下调(P<0.05),提示mi R-515-5p在体外负性调控PIK3CA的表达。(2)CCK8法检测结果提示,转染mi R-515-5p后鼻咽癌细胞较PIK3CA组增殖下降(P<0.05),提示mi R-515-5p逆转了PIK3CA对细胞增殖的促进作用。(3)转染mi R-515-5p后,鼻咽癌细胞随辐射量的增加细胞存活分数降低,PIK3CA组较对照组存活分数下降幅度小,差异具有统计学意义(P<0.05),PIK3CA促进鼻咽癌细胞的放疗抵抗,mi R-515-5p的上调逆转了PIK3CA诱导的对放疗抵抗的增强作用。流式细胞仪和western blot检测结果提示,PIK3CA过表达可抑制放疗导致的NPC细胞凋亡(P<0.05),而转染mi R-515-5p后PIK3CA抑制放射线所致的凋亡作用被消除(P<0.05)。综上所述,PIK3CA促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡,而mi R-515-5p在调节NPC细胞增殖、凋亡和放疗抵抗中与PIK3CA起着相反的作用。第三部分:(1)组织水平,与配对正常对照组织相比,NPC组织中PVT1上调,晚期(III+IV)的PVT1表达水平高于早期(P<0.05);而细胞水平,鼻咽癌中PVT1较鼻咽上皮细胞中上调,PVT1水平越高,细胞存活率越低(P<0.05),以上结果提示PVT1可能是鼻咽癌的癌基因,其高表达导致了NPC的预后不良。(2)通过sh-PVT1瞬时转染鼻咽癌细胞,细胞增殖CCK8试验提示鼻咽癌细胞中PVT1下调抑制NPC癌细胞的增殖;细胞克隆形成实验显示,细胞随辐照剂量(0,2,4,6,8Gy)的增高sh-PVT1组较sh-Control组存活分数下降(P<0.05),提示敲减PVT1后明显促进NPC细胞的辐射敏感性。流式细胞仪和western blot法检测发现,不同辐照剂量(0和8 Gy)下PVT1敲减后鼻咽癌细胞凋亡率升高,sh-Control组较sh-PVT1组细胞周期蛋白D1的增加、Bax水平的下降(P<0.05),PVT1沉默降低了细胞周期蛋白D1的水平,增加了放疗后Bax在NPC细胞中的表达。综上所述,敲减PVT1在体外抑制NPC细胞的增殖和放疗抵抗,并诱导细胞凋亡。(3)通过star Base发现mi R-515-5p载有PVT1的靶位点,双荧光素酶报告基因和RIP检测证实mi R-515-5p是PVT1的靶点。经q RT-PCR证实mi R-515-5p在体外受到NPC细胞中PVT1的负调控。(4)CCK8法检测结果提示,鼻咽癌细胞转染mi R-515-5p后增殖水平下降(P<0.05),但转染mi R-515-5p+PVT1后的鼻咽癌细胞较mi R-515-5p组增殖增加(P<0.05),PVT1的表达逆转mi R-515-5p对细胞增殖抑制。克隆形成实验及流式细胞仪检测同样提示,PVT1通过反向调控mi R-515-5p的作用,促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡。(5)经western blot检测发现,在鼻咽癌细胞水平,sh-PVT1组较对照组PIK3CA和p-AKT的蛋白质表达水平低(P<0.05),PVT1的下调降低了PIK3CA和p-AKT的水平;转染sh-PVT1+Anti-Control组较sh-PVT1+Anti-mi R-515-5p组逆转了这种作用(P<0.05)。结果表明,通过与NPC细胞中mi R-515-5p相互作用,PVT1在体外诱导了AKT通路。(6)裸鼠异种移植瘤模型实验证实,敲减PVT1在体内通过与PIK3CA发生作用,抑制了肿瘤的生长。结论:(1)PIK3CA蛋白在鼻咽癌组织中高表达,并与鼻咽癌的不良预后相关,PIK3CA基因表达下调能抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;鼻咽癌中PIK3CA存在异常甲基化,且其甲基化水平高于鼻咽正常粘膜组织。(2)mi R-515-5p在体外靶向调控PIK3CA,并负性调节PIK3CA的表达。PIK3CA促进NPC细胞的增殖及放疗抵抗,抑制了NPC细胞的凋亡,而Mi R-515-5p逆转了PIK3CA的作用。(3)PVT1在NPC组织中高表达,并与NPC的不良预后相关。mi R-515-5p是PVT1的靶点,并且在体外受到NPC细胞中PVT1的负调控。PVT1通过与mi R-515-5p相互作用,促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡。在体外PVT1通过与NPC细胞中mi R-515-5p相互作用,诱导了AKT通路,促进鼻咽癌细胞增殖和放疗抵抗。敲减PVT1在体内通过与PIK3CA发生作用,抑制了肿瘤的生长。PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移,并诱导鼻咽癌细胞放疗抵抗,导致鼻咽癌预后不良,本研究为鼻咽癌的发病机制和个体化靶向治疗关键分子筛查提供了新的靶点和思路。