人参皂苷是人参中具有药理学活性的主要成分,其中的稀有皂苷如人参皂苷Rh2,具有抗肿瘤、抗衰老、降血糖等活性,尤其在癌症的预防和治疗方面具有较强的活性。人参皂苷Rh2在天然人参中含量不到十万分之一,传统的方法是通过醇-水体系从人参根、茎、叶中提取,但提取后Rh2的含量仍然很低,因此,通过人工方法制备Rh2单体成为目前研究的热点之一。人参皂苷中含有大量的Rh2前体分子,均为带有不同糖基的四环三萜结构,因此,通过水解Rh2前体分子的糖基来制备人参皂苷Rh2理论可行。目前研究和应用较多的水解人参皂苷糖基的主要方法有酸碱水解、加热、酶催化等,单一使用酸碱水解或加热等方法条件剧烈,易产生副产物。使用糖苷酶对前体分子的糖基进行酶催化水解是目前研究的热点之一,条件温和、专一性高,但其往往只能高效催化一部分前体分子转化为Rh2,因此将酶催化与化学法结合起来,以提高前体分子转化为Rh2的转化率,是本课题的主要研究内容。该论文的主要研究成果如下:1.研究了经基因工程和蛋白质工程改造过的β-葡萄糖苷酶的制备条件。本研究所用的β-葡萄糖苷酶是通过对来源于Terrabacter ginsenosidimutans的葡萄糖苷酶进行基因突变,构建大肠杆菌高效表达系统,发酵获得β-葡萄糖苷酶的胞内酶,通过均质机在800bar条件下均质破胞,加入絮凝剂絮凝沉淀并离心后取上清即得粗酶液,无需纯化即可直接用于人参皂苷的酶催化。2.建立和优化了β-葡萄糖苷酶对人参皂苷前体物质的酶催化条件。结果表明,β-葡萄糖苷酶在温度为40℃、pH为7、酶浓度为20mg/ml、底物浓度为20%质量浓度时,即可将醇提后的PPD型皂苷混合物中前体分子完全转化。3.β-葡萄糖苷酶催化水解掉前体C-3位上的一个葡萄糖后,再酸水解掉C-20位上的其他糖基,考察了盐酸和醋酸水解的差异、温度、时间等,结果表明采用30%醋酸在75℃条件下水解8hr即可完全水解掉Rh2的前体获得Rh2,条件比盐酸更温和,收率高。4.开发了获得高纯度的人参皂苷Rh2的方法,并将Rh2纯品进行了结构确证。