类受体激酶（receptor-like kinase,RLKs）是植物细胞中重要的信号分子,在植物的许多生长发育及生理胁迫过程中起着重要作用。按照胞外配体结合结构域的不同可将RLKs分成22个亚类,其中富亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶（Leucine-rich repeat receptor-like kinase,LRR-RLKs）亚家族的 BAK1（BRI1-associated receptor kinase 1）和 CrRLK1-L（Catharanthus roseus receptor-like kinase）亚家族的 ANXUR 是调控植物细胞生长的两种重要蛋白激酶。BAK1是植物激素油菜素甾醇（Brassinosteroids;BR）受体蛋白BRI1的共受体,参与介导BR调控植物细胞生长的信号转导路径。ANXUR在花粉管尖端通过调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶的表达,从而控制细胞壁的完整性,影响花粉管的生长。但是,ANXUR作为植物中特有的蛋白激酶,其调控花粉管生长的具体机制还不完全阐明,以及其是否参与BAK1介导的油菜素内酯（Brassinolide,BL）信号转导路径目前还不清楚。为解析上述问题,本研究开展了系列实验,主要取得如下结果:1、对蔷薇科五个物种的LRR-RLKs亚家族进行分析并筛选出梨花粉中可能起重要作用的BAK1基因。LRR-RLK是RLK家族中最大的一个基因亚家族,参与植物的生长发育过程中众多响应。目前,LRR-RLK基因家族在已公布全基因组序列的五个主要的蔷薇科物种基因组中的进化模式尚未见报道。本研究深入分析了包括草莓（Fragaria vesca）、苹果（Malus domestica）、梨（Pyrus bretschneideri）、梅（Prunus mume）和桃（Prunus persica）在内的五个蔷薇科物种的LRR-RLK基因,分别包含201、244、427、267和258个LRR-RLK基因。研究进一步根据前人从4个植物物种中开发、定义的序列模型将所有的LRR-RLK蛋白根据序列相似性分为23个亚家族。RLK-PelleLRR-Ⅻ-1（Ⅻ-1）、RLK-PelleLRR-Ⅺ-1（Ⅺ-1）和RLK-PelleLRR-Ⅲ（Ⅲ）是其中三个最大的亚家族。共线性分析表明五个蔷薇科物种中有236个串联重复基因,其中Ⅻ-1（82个基因）和Ⅺ-1（80个基因）占比为68.6%。结果表明串联复制是LRR-RLK基因亚家族扩张的主要因素。基因表达、组织特异表达和亚细胞定位数据揭示了 LRR-RLK基因在不同器官和组织之间表达的差异,其中最大的亚家族Ⅺ-1在所有五个蔷薇科物种中都高表达。本研究从梨中鉴定了五个PbrBRI1基因和五个PbrBAK1基因,它们分别属于Xb-1和Ⅱ亚家族,分别命名为PbrBRI1a到PbrBRIle和PbrBAKla到PbrBAKle。总的来说,本分析结果为蔷薇科基因组中LRR-RLK基因家族提供了一个概览,并为进一步的功能研究提供了基础。2、通过实验发现外源表油菜素内酯（Epibrassinolide,epiBL）能促进梨花粉管的生长。通过离体培养和活体授粉两种方法用外源epiBL处理梨花粉,首先利用液体培养基离体培养‘砀山酥梨’花粉发现低浓度epiBL能促进花粉管生长,而高浓度epiBL则抑制花粉管生长,其中0.01 μM epiBL对梨花粉管生长促进作用最明显,外源油菜素甾醇（Brassinosteroids,BR）的合成抑制剂丙环唑（Propiconazol,PPZ）对梨花粉生长具有明显的抑制作用,且添加外源epiBL能在一定程度上恢复花粉管的生长。同时外源epiBL能促进花粉管微丝骨架的解聚,促进花粉管尖端活性氧（ROS）的积累和激活花粉管尖端和亚尖端Ca2+通道。另外,采用液体授粉的方法比较分析了加入外源epiBL,谷氨酸（Glutamic acid,Glu）和亚精胺（Spermidine,Spd）对活体花粉生长及萌发过程的影响,发现外源epiBL和Spd处理能促进花粉管生长量的增加并增加坐果率。这说明一定浓度的epiBL能促进花粉管生长发育,减轻低温等非生物胁迫对梨树授粉受精过程造成的不利影响,同时也为阐明油菜素内酯促进花粉管生长的作用机理提供了理论依据。3、研究表明,梨ANXURs（ANX1和ANX2）不能直接调控NADPH氧化酶活性,同时ANXURs的表达受外源epiBL的调控,但不是通过BAK1直接介导的。BAK1作为重要的类受体激酶,参与多条信号通路并作为共受体参与调控花粉管的生长等多个过程,ANXURs作为另一种重要的受体激酶在花粉管中特异表达,并能通过调节NADPH氧化酶活性调控花粉管的生长。梨PbrBAK1d、PbrANX1和PbrANX2都在花粉中有表达,且都定位在细胞原生质体膜上,本实验发现梨PbrANX1和PbrANX2基因的表达受到外源epiBL的调控,采用反义寡聚脱氧核苷酸（Antisense Oligodeoxynucleotide,A-ODNs）技术抑制梨花粉中PbrBAK1d后发现花粉管生长被抑制,而抑制梨PbrANX1和PbrANX2基因后则能促进花粉管的生长,这说明BAK1和ANXURs调控花粉管生长不是同一条信号路径。利用酵母双杂和双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）实验发现梨和拟南芥BAK1和ANXURs基因没有直接互作关系,同样发现ANXURs和呼吸爆发氧化酶同源基因（Respiratory burst oxidase homologue,RBOH）H和J也没有直接互作关系。这说明ANXUR受体激酶调控花粉管生长不是通过直接磷酸化Rboh H和Rboh J完成的,而ANXURs则可能与BL信号通路中的其它蛋白相互影响从而介导BL调控花粉管生长的信号通路。4、研究发现丝裂原活化蛋白激酶MAPK（Mitogen activated protein kinase）处于ANXURs的下游接收信号并激活NADPH氧化酶活性从而调控花粉管生长。ANX1和ANX2作为CrRLK1-L亚家族的重要蛋白,它们具有典型的单跨膜受体激酶结构,参与调控花粉管的生长,同时丝裂原活化蛋白激酶MAPK最易识别具有跨膜结构的蛋白受体激酶,而目前还没有MAPK直接调控花粉管生长的相关报道。ANXUR参与调控花粉管生长不是通过直接与Rboh H/J相互作用而完成的,本研究以梨PbrANX1基因的胞内域（PbrANX1-intracellular domain,PbrANX1-ID）为诱饵在‘砀山酥梨,花粉核质蛋白酵母文库中筛选到两个与拟南芥AtMPK3和AtMPK6基因相似的序列片段,通过比对从‘砀山酥梨’基因组中筛选出四个MAPK基因,分别命名为PbrMPK5、PbrMPK7、PbrMPK15和PbrMPK18。通过酵母双杂和农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞发现PbrMPK18与PbrANX1能相互作用,同时拟南芥基因AtANX1和AtANX2与AtMPK3和AtMPK6也相互作用,并且当ANXURs的胞内域完整存在时才能与MPK相互作用。另外发现PbrMPK18与PbrRboh H和PbrRbohJ之间也存在互作,同样拟南芥AtMPK3/6与AtRboh H/J也分别两两互作。本实验表明MAPK处于ANXUR的下游,将ANXUR胞外域接收的信号传递到细胞内,然后MAPK通过与Rboh H/J互作来诱导活性氧的产生,从而调控花粉管的生长。总之,本论文在课题组长期研究基础上,以木本果树梨的花粉为主要对象,综合应用生理测定、基因克隆、组织和细胞定位、功能分析以及信号转导路径构建等技术手段和研究方法,深入解析了不同类受体激酶亚家族基因在调控梨花粉管生长中的促进或抑制作用,通过药理学和遗传学等研究策略,在分子层面上探讨了 BAK1和ANXUR调控梨花粉管生长发育的信号路径,研究结果为梨生产关键环节授粉受精中花粉管生长发育调控提供了理论指导。