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工作目的：结肠癌是最常见的恶性肿瘤性疾病之一,随着我国老龄化的加剧及饮食生活习惯的改变,结肠肿瘤的发病率与死亡率均逐渐上升。研究发现,炎症性肠病,肥胖,过量摄入红肉及加工肉制品,饮酒过度,吸烟及糖尿病等均对结肠癌的发生发展产生影响。目前结肠癌的治疗方法多种多样,如手术、局部肿瘤放疗、化疗及生物治疗等。尽管如此,结肠癌患者整体预后仍不理想,进展期结肠癌的患者临床疗效较差。因此研究结肠癌治疗新方法具有重要的科学意义和临床价值。三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)是中医当中常见的中草药,其块茎及全草均可入药,有清热解毒、活血止痛等功效,被用于肺炎、肝炎、发热、痛经、哮喘及关节炎等炎症性疾病的治疗。三叶青的块茎内黄酮类化合物包括原花青素B1、原花青素B2、儿茶酸、芦丁、异槲皮苷及黄芪多糖等,这些混合物被称为三叶青总黄酮(Total Flavonoids of Tetrastigma Hemsleyanum,TFTH)近年来多项研究表明,TFTH对多种肿瘤,如肝癌、宫颈癌等均有较强的抑制作用。本文对TFTH在结肠癌中对细胞增殖及侵袭转移的影响进行探讨,并进一步探索其调控机制。研究方法：本实验选用了结肠腺癌的原位肿瘤细胞株HT29及腹腔淋巴结转移肿瘤细胞株SW620,并向结肠癌细胞中加入不同浓度的TFTH进行培养。CCK-8细胞增殖试验及平板克隆形成试验用于检测TFTH对结肠肿瘤细胞株HT29及SW620增殖能力的影响,细胞划痕试验及Transwell侵袭试验用于检测结肠癌细胞侵袭转移能力。流式细胞术检测TFTH干预后细胞周期变化。免疫印迹及实时荧光定量PCR用于进一步探索TFTH对肿瘤细胞通路及蛋白质表达的影响。体内实验方面,用10mg/ml氧化偶氮甲烷及2%葡聚糖硫酸钠诱导C57BL/6小鼠的慢性炎症相关结肠肿瘤的模型,动态观察TFTH灌胃治疗对小鼠体重变化的影响,并计算小鼠结肠肿瘤数量及大小,HE染色观察肿瘤病理改变,免疫组化观察肿瘤细胞内蛋白质表达。结果：予以不同浓度含TFTH培养基培养人结肠癌细胞HT29及SW620后,CCK-8细胞增殖试验及平板克隆形成试验检测发现随着TFTH干预浓度上升,结肠肿瘤细胞增殖能力逐渐降低(P<0.05)。细胞划痕试验及Transwell侵袭试验亦可见浓度依赖性的结肠癌细胞侵袭转移能力下降(P<0.05)。流式细胞术结果显示细胞周期受TFTH影响：在TFTH作用48h后,处于S+G2/M期的结肠肿瘤细胞比例明显下降,而G0+G1期比例增加,其抑制程度与药物浓度正相关(P<0.05)。进一步研究发现,用含TFTH的培养基培养后,细胞内β-catenin,总蛋白水平不变,而磷酸化的β-catenin明显减少(P<0.05)。同时,TFTH呈浓度依赖性地抑制了Lgr5,Cyclin D1,c-Myc及E-Cadherin等Wnt/p-catenin下游靶蛋白在mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05)。动物模型中,予以不同浓度TFTH灌胃治疗后的小鼠可见其体重减轻趋势减缓,结肠肿瘤生成数量及大小均明显降低,肿瘤恶性程度较轻,免疫组化染色发现TFTH治疗可抑制Wnt通路的靶基因Cylin D1和Lgr5的表达,且高浓度TFTH干预组的改变更显著(P<0.05)。结论：本研究证明,TFTH可阻滞细胞周期,抑制上皮-间质转化过程,有抑制结肠肿瘤细胞的增殖及转移的作用。更重要的是,本研究首次证实TFTH对肿瘤的影响与下调Wnt/β-catenin通路相关。TFTH干预后结肠癌细胞内Wnt通路活化程度下降,下游增殖及侵袭相关靶基因如Lgr5,Cyclin D1, c-Myc及E-Cadherin等表达均受抑制。动物模型同样验证TFTH对结肠肿瘤发生发展的抑制作用,并可观察到Wnt通路下游蛋白表达降低。本研究证实三叶青总黄酮通过对Wnt/β-catenin通路的调控影响结肠肿瘤细胞的增殖和转移能力,从而抑制结肠癌生长。本文结合中医理论及现代药理研究方法,验证了中草药三叶青块茎中的有效成分,三叶青其本身毒副作用微弱,块茎富含黄酮类化合物,并表现出较显著的肿瘤抑制作用,为将来临床治疗恶性肿瘤,尤其是进展期肿瘤及产生化疗药物抵抗的肿瘤病人提供了新的治疗方向。