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目的:红树林(mangroves)是指以红树植物为主的,生存在盐度较高土壤中并受周期性高盐海水浸渍,具有独特结构和功能的木本植物群落。海桑属(Sonneratia)红树植物作为红树林的主要组成部分,具有较高的药用和食用研究价值。其中,无瓣海桑(Sonneratia apetala)为海桑属主要红树树种,常用来治疗肝炎、扭伤、出血和腹泻等疾病。其果实可食用,内含果胶,具药食同源特性。现代药理学研究表明,无瓣海桑果实具有抗氧化、抗炎和保肝等药理作用。且前期研究发现,其保肝作用可能与其所含多糖有关。近年来,许多天然多糖因其疗效好、副作用小的特点,作为防治肝组织损伤的热点药物被广泛研究。肝脏作为体内物质代谢和解毒的主要场所,易受到药物、有毒物质和酒精等的侵害,造成肝细胞坏死或凋亡、肝组织结构改变,引起肝脏损伤。其中,随着临床用药种类以及剂量的增加,药物性肝损伤的发生频率逐渐增加。因此,寻找具有防治肝脏损伤的药物成为医药研究人员关注的重点。因对乙酰氨基酚(APAP)服用过量引起的肝脏损伤在临床药物性肝损伤病例中所占比例最大,现代药理学研究常通过APAP诱导的肝损伤模型来寻找有效的肝损伤的治疗药物。为此,本实验先对无瓣海桑果实多糖进行初步表征,并通过体外抗氧化活性实验评价其抗氧化活性,再通过APAP所致肝损伤小鼠模型来探究其抗药物性肝损伤作用及潜在机制。方法:1.初步表征采用水提醇沉法来提取无瓣海桑果实多糖,再利用DEAE-52纤维素和Sephadex G-100层析柱对无瓣海桑果实多糖进行分离纯化,再对其多糖、糖醛酸、硫酸根和蛋白含量进行测定,采用红外光谱法对无瓣海桑果实多糖的结构进行分析,从而对其进行初步表征。2.体外抗氧化活性的评价测定无瓣海桑果实多糖对DPPH、超氧阴离子和羟自由基的清除能力以及还原能力,综合评价无瓣海桑果实多糖的体外抗氧化活性。3.抗APAP致肝损伤作用及机制研究将ICR小鼠随机分6组:正常对照组(NC),模型组(APAP),阳性药组(NAC)以及无瓣海桑果实多糖低、中和高剂量组(100、200和400mg/kg)。各组均采用灌胃方式给药,每次给药前记录小鼠体重。除正常对照组和模型组给予相应体积的蒸馏水外,其余四组均以0.1 mL/10 g的给药体积给予对应药物,每天给药一次,连续给药30天。于末次给药8h后,除正常对照组小鼠给予腹腔注射生理盐水处理外,其余各组小鼠均腹腔注射220 mg/kg的APAP生理盐水溶液构建APAP所致肝损伤模型。禁食12h后,对各组小鼠进行再次称重,取血后处死,剖取肝脏并称重,记录,计算肝脏指数。于小鼠肝脏的同一部位剪取肝组织,经多聚甲醛固定后,进行HE染色,用于肝脏组织病理学评价;分离血清,用生化试剂盒测定血清中转氨酶ALT和AST水平;取一定量肝组织制备肝组织匀浆,采用生化定量法测定肝组织匀浆中GSH、MDA含量以及GSH-Px、SOD活性;运用ELISA技术测定肝组织中TNF-α和IL-6的含量;利用 PCR 技术分析检测 CYP2E1、GCLC、GCLM、HO-1、NQO1、TNF-α 和 IL-6 的mRNA 含量;采用 Western-blot 技术检测CYP2E1、JNK、P-JNK、Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、Bc12、Bax、Nrf2、Keapl、GCLC、GCLM、HO-1 和 NQO1 的蛋白表达,进一步研究无瓣海桑果实多糖对APAP所致肝损伤小鼠的保护作用机制。结果:1.无瓣海桑果实经提取分离后得到无瓣海桑果实粗多糖(SAP),后经DEAE-52纤维素和Sephadex G-100层析柱处理,共得到SAP1、SAP2和SAP3三个多糖,其中SAP1和SAP2为SAP的主要组成部分,占其含量的98%以上。对两者进行化学分析,结果发现SAP1和SAP2的多糖含量分别为68.75%和56.15%,糖醛酸含量分别为19.65%和40.40%;硫酸根含量分别为4.52%和2.30%;蛋白含量分别为7.08%和1.00%。两者均有较高含量的糖醛酸,为酸性多糖。红外光谱分析结果显示,SAP1和SAP2均具有多糖的特征吸收峰,且糖苷键类型为α-吡喃糖苷键。SAP1可能主要含有α-吡喃葡萄糖、α-吡喃半乳糖、α-吡喃甘露糖和α-吡喃木糖,SAP2可能主要含有α-吡喃葡萄糖和α-吡喃木糖。2.无瓣海桑果实多糖具有较好的体外抗氧化活性,可有效清除DPPH、超氧阴离子和羟自由基,并具有一定的还原能力,且SAP的体外抗氧化活性强于其两个分离组分。3.经APAP造模后,各组小鼠与正常组相比,肝脏指数显著增大,血清转氨酶升高,说明肝损伤模型建立成功。经药物处理后,与模型组相比,SAP能显著降低小鼠肝脏指数、血清ALT和AST水平,改善肝脏病理损伤,提高GSH含量、GSH-Px和SOD活性,降低MDA含量以及炎症因子TNF-α和IL-6的水平;增强GCLC、GCLM、HO-1和NQO1的mRNA表达,并对CYP2E1的mRNA表达有抑制作用;此外,SAP能够减缓APAP所致肝损伤小鼠肝组织中JNK的磷酸化,抑制CYP2E1、细胞凋亡相关蛋白(Cleaved-Caspase 3、Bax)以及Nrf2信号通路相关蛋白(细胞质中Nrf2和Keap1)的表达,同时促进 Caspase3、Bc12、GCLC、GCLM、HO-1、NQO1 以及细胞核中Nrf2的表达。结论:综上所述,无瓣海桑果实多糖主要是由糖苷键为α-吡喃糖苷键的SAP1和SAP2两种酸性多糖组成,其中,SAP1主要由α-吡喃葡萄糖、α-吡喃半乳糖、α-吡喃甘露糖和α-吡喃木糖组成,SAP2主要是由α-吡喃葡萄糖和α-吡喃木糖组成;体外抗氧化活性评价实验验证了无瓣海桑果实多糖具有较好的体外抗氧化活性;体内抗APAP致肝损伤实验表明了无瓣海桑果实多糖具有抗APAP所致肝脏损伤作用,其作用机制可能与提高机体抗氧化能力,抑制氧化应激、炎症反应和细胞凋亡,以及调节CYP2E1表达和Nrf2信号通路有关。