猪圆环病毒（porcine circovirus type, PCV）是一种环状、无囊膜的单股DNA病毒，它包括猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）两个基因型。其中圆环病毒2型具有致病性，能够引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种疾病，并可以引起猪的免疫抑制。2000年我国第一次报道猪群检测出PCV2，随后多个省市陆续报道了PCV2的感染，流行呈现逐渐蔓延的趋势。该病毒往往与其他病原混合或继发感染，给我国养猪业造成了巨大损失，严重影响了我国养猪业的发展。近年来，各国学者对PCV2的病原学研究和防控技术研究逐渐深入，但目前PCV2病原学及流行病学许多问题仍未解决，该病毒山东省等地的流行规律、危害，尤其是在2010年以来，经过疫苗大面积使用之后的流行规律还未见报道。PCV2的致病机理仍然处于探索阶段，PCV2感染引发细胞信号转导的研究有助于阐明PCV2的致病机理。PCV2感染PK-15细胞中JAK-STAT信号通路的激活机制，JAK-STAT信号通路是如何抑制病毒蛋白表达和病毒增殖，与病毒的复制相关性尚未见报道；因此，本研究对山东省PCV2的分子流行病学情况进行了调查；对山东分离株和其他PCV2分离株全基因组序列和主要保护性抗原蛋白序列进行了分析，应用本实验室建立的PK-15细胞α-IFN效应因子实时荧光定量RT-PCR检测方法和PCV2病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法，并进一步研究了JAK-STAT信号通路与PCV2感染的相互关系。以下分三部分论述：1.山东省猪圆环病毒2型流行病学调查与PCV2毒株分离及其感染增殖特性研究为了掌握PCV2在山东省猪群中的感染和流行情况，为猪圆环病毒病的防制提供参考，2010年~2012年对山东100余家大中型猪场进行猪圆环病毒流行病学情况调查，采用PCR技术和ELISA方法分别对采集的猪抗凝血和疑似猪圆环病毒感染病猪的淋巴结、脾脏、肺脏等脏器样品进行PCV2抗原及抗体检测。结果显示，2010年、2011年、2012年抗体阳性率分别为72.95%、61.85%和59.89%；核酸阳性率分别为34.66%、29.59%、21.38%。在流行病学调查的基础上，用PCV2抗原检测阳性的病料感染PK-15细胞，获得2株PCV2病毒的分离株。将其盲传20代后病毒滴度为分别为106.0TCID50/ml和106.2TCID50/ml，通过对其中一株PCV2SD-JN株进行病毒的生长曲线测定发现，PCV2在细胞中生长至第72小时后，达到TCID50的最高峰106.2TCID50/ml。PCV2分离株的获得，对进行病毒体外增殖特性研究，阐明PCV2与细胞间的相互作用机制，进一步研制高效优质的PCV2疫苗奠定了基础。2.猪圆环病毒2型分离株遗传演化、时空界定及PCV2b山东株全基因序列分析为了解山东省PCV2流行株的遗传变异情况，2010～2012年，本研究从患病猪组织、血样中扩增克隆出PCV2的全基因组序列，获得8株PCV2山东株全基因序列，其中PCV2b型为7株。同时对2005～2012间本实验室获得的26株山东分离株进行了核苷酸和主要蛋白氨基酸序列分析。结果发现，26株山东PCV2分离株核苷酸同源性为69.9%-100%，其中2006年分离的DQ478947与2010年分离的HM142894同源性最低。应用DNAStar分析软件对26株山东分离株Rep蛋白氨基酸序列和Cap蛋白氨基酸序列进行了分析，结果表明，根据Cap蛋白第86-89位氨基酸序列为SNPR(L)或者TNKI判断，26株PCV2山东分离株中，HM142897、HM142900和SD8-1三株序列第86-89位氨基酸序列为TNKI，为PCV2a亚型，其余的23株均为SNPR(L)，为PCV2b亚型。26株PCV2ORF1编码的314或315个的氨基酸，ORF2编码233、234或235个的氨基酸，Rep蛋白的氨基酸同源性为98.3%-100%，Cap蛋白的氨基酸同源性为83.7%-100%。Rep蛋白上的三个潜在的糖基化位点24aa-26aa(NPS),256aa-258aa(NQT),286aa-288aa(NAT)均没有变化。Cap蛋白变异较大，主要变异区位于51aa-78aa,121aa-134aa,169aa-215aa。将2005～2012间本实验室获得的26株山东分离株与GenBank登录的国内外其他PCV2全基因序列共90株，进行核苷酸进化树和ORF2编码氨基酸进行分析，结果表明，PCV2的流行经历了1998年至2002年以PCV2a亚型为主要流行毒株阶段，2003年为PCV2a和PCV2b亚型并存阶段，2003年至今以PCV2b为主要流行毒株阶段的三个阶段演变过程。PCV2b亚型中国分离毒株在遗传进化上，以秦岭淮河为界限，按照地域分为了中国南部和中国北部两个大的集群。从ORF2进化树分析看出，26株山东分离株中，24株的ORF2基因集中分布于进化树两端的两个大分支上，其中9株位于进化树的上部A区分支上，与法国、匈牙利分离株遗传距离较近，15株位于进化树的下部B区分支上，与英国分离株遗传距离较近。3.JAK-STAT信号通路与PCV2感染的相互作用由于α-IFN激活JAK-STAT信号通路后，激活α-IFN效应因子Mx1、OAS基因转录表达，因此本实验室根据GenBank中收录的猪β-actin、Mx1、OAS基因序列，选择其中的保守区，利用Premier5.0软件设计相应的引物，建立了针对对PK-15细胞的β-actin、Mx1、OAS基因的荧光定量PCR方法。参照该方法进行α-IFN的最佳作用时间和最佳作用浓度筛选。发现使用浓度为750U/ml的α-IFN，处理PK-15细胞12小时后，α-IFN的效应因子Mx1、OAS相对表达量最高，因此确定α-IFN处理的最佳作用时间为12h，最佳浓度为750U/ml。分别对JAK-STAT信号通路特异性抑制剂AG490最佳作用浓度以及最佳作用时间进行优化。结果发现，使用10μM的AG490作用于α-IFN处理的PK-15细胞6小时后，OAS的相对表达量达到最低点接近空白对照细胞，而12小时左右Mx1的表达量才达到相对表达量最低，接近空白对照细胞，基本完全阻断JAK-STAT信号通路，从而确定将AG490的最佳作用时间定为12小时，最佳作用浓度为10μM。以PK-15细胞作为空白对照，通过检测分组检测不同时间点OAS和Mx1基因的相对表达量发现，当PK-15细胞接种PCV2后，OAS和Mx1的相对表达量高于空白对照细胞低于α-IFN激活细胞JAK-STAT信号通路组。以PCV2单独感染组作为对照感染组，利用本实验室建立的PCV2特异性荧光定量PCR方法，对PCV2的最佳收获时间进行确定并检测不同分组PCV2的绝对表达量。结果发现，随着培养时间的增长，病毒液中PCV2的含量逐渐增加，于接毒后72h病毒含量到达顶峰（3.109×108copies），随后病毒含量开始逐渐降低。应用AG490抑制JAK-STAT信号通路后，PCV2的病毒绝对表达量量高于对照感染组，而通过α-IFN激活JAK-STAT信号通路组，PCV2病毒绝对表达量大大低于与PCV2单独感染组。结果表明，PCV2的感染能够激活PK-15细胞中JAK-STAT信号通路，但信号通路的激活又会反过来抑制PCV2在细胞中的增值。本研究明确了PCV2感染PK-15细胞与JAK-STAT信号通路的相互作用，丰富了PCV2的感染和发病机制理论，为阐明PCV2组织细胞感染致病机理奠定了基础。更为预防和控制PCV2的感染，研制PCV2型的新型疫苗提供新的靶向分子。