第一章 粪菌移植中供体筛选标准与流程的建立与优化研究背景与目的粪菌移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)是一种新型“器官移植”,将人体中最大的免疫器官消化道视作介导途径,通过将健康人群(供体)的粪便进行一系列过滤、富集,将其中的有益菌群和功能菌群移植到患者的胃肠道内,使其定植于消化道内以达到修复、改善或重塑患者的肠道微生态环境,进一步发挥正常的肠道菌群功能以参与重要的调控与代谢,从而达到治疗与微生物相关的肠内与肠外疾病。已于2013年被美国食品和药物管理局(FDA)正式列为CDI与rCDI的一种替代疗法纳入治疗指南。目前已在难治性难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性性肠病、肠易激综合征、慢性腹泻、慢性便秘、自闭症、肝性脑病以及一些与代谢性疾病相关的肠道外疾病中得到不断的研究与应用。随着微生物组学的发展与测序技术的进步,菌群之间的共生作用以及参与生物代谢调控逐渐被认识到。大量研究表明菌群紊乱与一系列疾病存在关联性,包括艰难梭菌感染、炎症性肠病、肥胖、哮喘、抑郁等。粪菌移植能够改变患者原有的肠道菌群结构与组成,并使其趋向于粪菌供者的菌群构成。因此在移植过程中存在原供体潜在威胁性菌群导致宿主新发疾病的风险。虽然目前国际上已有共识指南用于指导FMT的临床应用,但关于供体尚需要进一步高质量的研究。本研究首次提出供体筛选标准化与多维度的概念,拟初步探索规范并优化供体筛选标准与流程,以期实现统一标准流程的建立,为FMT的有效性、安全性评价提供更高的证据。研究方法1.确立标准化筛选流程,确定严格规范全面的筛选标准通过检索Pubmed、MEDLINE等数据库,设置检索关键字如下,包括“FMT”、“fecal transplant”、“fecal microbiota transplantation”、“faecal transplant”、“donor”、“fecal donation”、“fecal donor”、“faecal donor”等,经过筛选从中共得到 48 项结果,共涉及供体215例,统计分析后根据所有研究中的供体特征与纳排标准作出改进,并添加入新的考量元素,建立唯一的筛选流程与标准,以个人信息登记表、系列问卷的形式呈现,丰富实验室检验筛查项目,尽可能地全面谨慎,在现有的肠道微生物机制研究的前提下,尽量规避可能带来移植风险的因素。2.筛选合格供体广泛宣传招募,严格按照经研究后制定的流程与标准进行筛查,符合筛选条件后向备选供体详细解释粪菌移植的原理,待其表示充分理解后签署捐赠知情同意书后方可成为该项目中合格的粪菌捐赠供体。3.收集供体的粪便样本进行16sRNA测序按照观察点规范采集供体的粪便样本,冻存于-80℃冰箱中,提取其DNA后送至I-Sanger平台(上海美吉生物医药科技有限公司Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co.,Ltd)进行 16sRNA 测序。研究结果1.通过文献分析确立本研究中标准化的供体筛选条件与流程供体经过对48项研究的文献分析,其中供体共215例,对其各项特征进行分析总结,在33项(33/48,68%)研究中提到了供体性别,52.6%的供体为男性。在29项(29/48,60.4%)研究中提到了供体年龄,供体平均年龄为27.5岁。33项(33/48,68.7%)研究对供体提出了 BMI值的要求,供体的平均BMI值为21.8kg/m2。215例供体中仅11例与受试者有亲属关系。排除条件、筛选项目均体现出对传染源的重点筛查。通过对上述文献研究结果的整合再分析,探寻标准化供体筛选的雏形,设计出本研究中的筛选条件、筛选问卷。2.经标准化筛选条件与流程筛选出2名合格稳定供体共招募92名健康青年志愿者,其中2人不符合年龄要求,12人不符合BMI指数要求,68人不符合调查问卷,8人未能通过实验室指标筛查,仅2人符合所有筛查要求,合格率为2.17%(2/92)。通过对供体各时间点粪便菌群的纵向对比,对菌群多样性指数与菌群丰度指数进行对比检验,结果显示在纵向的6个月内,各粪便取样点的样本的指数无统计学差异,表明供体的粪便菌群在该观察期内体现出菌群结构与组成的动态稳定。讨论在本研究中,通过对现有全球性的FMT临床试验研究的整合分析,从中发现,关于FMT其临床应用面越来越广泛。而FMT施行的流程方案,尤其是在粪菌捐赠供体的筛选上呈现出较大的差异性,因此,寻求高效的标准化FMT方案对于推广临床应用势必是一个必不可少的策略。根据对48项临床研究中的供体特征分析,发现大多数临床研究更加偏爱男性供体,可能是基于女性生理周期或激素水平波动较不稳定以及备孕怀孕状态的考虑。供体的年龄多位于20-30岁区间,慢性药物包括抗生素的使用以及一些疾病史的考虑排除了老年人作为供体的可能,而儿童的肠道微生物构成尚不成熟稳定,因此迄今为止尚缺乏儿童粪便捐赠供体。供体的排除标准与筛查项目作为最重要的部分在48项临床研究中呈现出极大的特异性与不完整性,且具有明显的种族、地域特点。在北美的研究中,多会重点关注到特定的病毒和寄生虫,例如美国常见的肠道寄生虫贾第虫。而亚洲的研究则主要集中于排除局部地方性的肠道病原体,相反并不是很重视病毒或寄生虫的筛查。针对药物服用的限制时间,多数研究给出了明确的限制为3个月,而在最新的欧洲粪菌移植指南共识中则给出了 6个月限制期的高级证据支持。现有的供体筛选方案仅能够针对已知的疾病进行筛除,因此“理想”的供体可能需要更加全面的病史排除条件。新鲜的粪菌菌液相较于冻存的粪菌仍然是主流的治疗应用形式。目前有三项研究利用混合的多供体粪菌菌液进行FMT疗效的比较探究,与单一供体的疗效相比显示出一定的优势。经结肠镜检查方式与灌肠方式是研究中最为常用的粪菌菌液导入途径。本研究基于上述分析,首次提出“标准化粪菌移植供体筛选”的概念,从人群、生理、心理、环境等进行多维度立体的考量,整合出标准化的筛选问卷与筛选流程,为FMT的临床治疗应用提供更高的安全性基础。第二章粪菌移植强化治疗在炎症性肠病中的疗效评估研究背景与目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)在过去的60年间发病率急剧上升,是一种病因尚不明确的慢性非特异性疾病。流行病学调查与临床的大量机制研究显示IBD患者的肠道菌群存在明显的菌群紊乱与异构,其菌群的多样性与丰度较健康人群均有所降低,其被认为可能与调控代谢的异常相关,从而触发肠道内的免疫损伤或缺陷。而FMT作为一种具有修复或重塑肠道菌群的干预疗法而受到越来越多的关注,与之在艰难梭菌感染上优于传统标准抗生素治疗方法的有效率与缓解率,因而被认为可能会诱导炎症性肠病患者达到临床缓解或内镜下的黏膜改善。迄今为止,全世界已有超过数千例将FMT应用与IBD临床治疗的案例,但由于尚无统一的规范的关于FMT方法学的研究,导致FMT在IBD治疗的有效性上,多数研究结果并不一致。因此在整个FMT治疗体系中,供体选择的侧重点、粪菌的过滤提取方式、移植方式、导入途径、FMT的最佳剂量、移植的频次等诸多方面仍需要进一步深入的研究,且关于FMT的长期安全性与否,仍缺乏足够的临床数据支持。本研究拟在建立并优化供体筛选的基础上,更换传统的灌肠或结肠镜下喷洒的移植方式,并在此基础上加强FMT移植频次,予FMT强化治疗方式观察与评估其对于炎症性肠病患者的临床效价。研究方法与结果1.研究对象严格按照制定的纳入标准与排除标准,入组经南方医院消化内科诊断为溃疡性结肠炎或克罗恩病的患者。2.研究方法所有受试者至少在治疗前4天停止一切常规针对炎症性肠病治疗的药物(包括5-ASA、抗生素、激素、免疫抑制剂、益生菌等)。经结肠镜下行TET管置管术后行FMT强化治疗,即在治疗周期的第一、三、五天分别经TET管输注粪菌菌液。以治疗后第12周作为试验终点以评估治疗干预的临床效价。并分别在治疗前和治疗后第1周、第4周、第12周、第24周进行详细的跟踪随访,从临床症状、心理状态、实验室检查指标等方面观察评估FMT强化治疗带来的临床改善或影响,并同时进行不良事件的追踪随访与评估。所有受试者均需随访至治疗后24周。并通过粪便基因组16sRNA测序分析受试者接受FMT强化治疗前后粪便菌群结构与组分的变化,探寻其中起到关键作用的功能通路。3.研究结果3.1.受试者基本特征在本试验中的13例炎症性肠病受试者,其中溃疡性结肠炎10例,克罗恩病3例。所有受试者均完成了 24周的跟踪随访。受试者平均年龄为37.3岁(范围为18～56岁),其中男女比例为7:6。吸烟者3人。受试者患病时长平均时长为4.77年(范围为1～11年),UC受试者改良的Mayo评分为7.9分,CD受试者Best CDAI评分为205.50分。3.2.粪菌移植强化治疗能够明显改善受试者临床症状13例IBD受试者中,10例UC受试者,3例CD受试者,均完成了第12周试验终点的观察记录与评价,并完成了 24周的跟踪随访,无失访病例。其中,4例UC受试者达到临床缓解(4/10,40%);4例UC受试者达到临床有效(4/10,40%)。1例CD受试者达到临床缓解,其余2例CD受试者临床无效。粪菌移植强化治疗后,对治疗产生有效应答或达到临床缓解的受试者在试验终点,其实验室检验指标如白细胞数、中性粒细胞数、血红细胞沉降率呈明显下降(P<0.05),血红蛋白含量呈明显上升(P<0.05),C反应蛋白也呈显著下降,但是与FMT强化治疗的相关性可能尚不充分。治疗前后体重明显升高。同时在试验终点对受试者的内镜结果及肠道粘膜病理与治疗前进行对比,4例达到临床缓解的受试者,其肠镜检查显示“黏膜较光滑,血管纹理清晰,无活动性炎症”,肠道黏膜组织病理显示:黏膜基本正常,黏膜下层少量炎性细胞浸润,轻度血管充血;4例产生有效应答的受试者其肠镜检查显示“黏膜轻度充血,未见溃疡、新生赘生物”,肠道黏膜组织病理显示:部分被覆上皮脱落,邻近黏膜基本正常,黏膜下层炎性细胞浸润较前明显减少。除上述临床指标之外,在试验终点,达到临床缓解或产生有效应答的受试者,其Mayo评分(P<0.05)、Best CDAI评分(P=0.43)、腹痛评分(P<0.05)、稀便次数(P=0.171)以及抑郁评分(P<0.05)均呈现显著降低,但其中稀便次数的变化与FMT强化治疗的相关性仍未能确定。3.3.粪菌移植强化治疗后炎性细胞因子出现明显改变FMT强化治疗前后,促炎因子IL-1β(p<0.05)、TNF-α(p<0.05)呈显著下降趋势,抑炎因子IL-10(p<0.05)、TGF-β(p<0.05)呈显著上升趋势。3.4.粪菌移植强化治疗能够显著改变受试者粪便菌群的结构与组成在FMT移植后,受试者的厚壁菌门比例上升(p<0.05),变形菌门比例降低(p<0.05),具核梭杆菌比例明显降低(p<0.05)。在产生应答与达到临床缓解的受试者的肠道菌群分析中,其肠道菌群的物种丰富度与多样性相较于治疗前的自身呈现出显著的升高,且在各粪便标本收集时间点明显高于非应答者。3.5.粪菌移植强化治疗中发挥显著作用的功能通路丰度与代谢信息受试者粪菌微生物主要的COG功能包括:能量生产与转换、氨基酸转运与代谢、核苷酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、辅酶转运与代谢、脂质转运与代谢、无机离子转运与代谢。其中最主要的为碳水化合物转运与代谢。该分析结果表明,受试者经粪菌移植强化治疗后粪便样本中的微生物代谢功能趋于丰富。经比对到KEGG数据库的信息,所获得的优势代谢通路为糖酵解/糖异生途径。4.讨论本次试验研究表明,粪菌移植强化治疗是一种治疗炎症性肠病患者的有效手段。本研究进一步证实了重塑肠道内环境能够有效奠定发挥粪菌移植治疗作用的强大基础。同时也进一步明确供体作为整个疗法基础来源的重要性,该研究将能够极大推广粪菌移植的临床应用,而供体也必然将在未来的应用中伴随着肠道微生物的深入研究得到更为长足的进步与改善。与此同时本研究结果显示,FMT可能通过参与功能代谢通路调控相关炎性因子的表达,为FMT发生发展机制的探索研究提供了前期临床基础。