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狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种侵害中枢神经系统的重要人兽共患传染病，一旦发病，病死率几乎为100%。狂犬病病毒为弹状病毒科、狂犬病毒属成员。其基因组为单股负链RNA，能够转录和翻译5种结构蛋白，分别为基质蛋白（M），核蛋白（N），磷蛋白（P），糖蛋白（G）和转录酶大蛋白（L）。基质蛋白（M）为狂犬病病毒5种结构蛋白中分子量最小的结构蛋白,该蛋白在结构上形成糖蛋白与核糖核蛋白体间的连接，功能上则与狂犬病病毒粒子的释放及病毒毒力有关。国外对基质蛋白的报道较多，而国内相关研究的报道较少。腺病毒表达系统是近年来广泛应用的真核表达系统之一，因其可对外源蛋白进行正确表达和修饰，且操作简单，使用安全，因此在兽医学研究领域也得到了广泛应用。表达目的蛋白的重组腺病毒已广泛用于疫苗研究、病原检测技术研究以及病毒结构蛋白的功能研究等领域。本研究拟构建表达狂犬病病毒基质蛋白（M）的复制缺陷型人5型腺病毒，明确重组病毒生长和表达外源蛋白的特性，并对其感染细胞后基质蛋白的表达进行细胞内定位，为基质蛋白功能研究奠定基础。以狂犬病病毒强毒BD06株脑内注射感染小鼠，取感染死亡小鼠全脑，提取总RNA，以RT-PCR法扩增获得600bp左右的基质蛋白基因，连接入pMD18-T载体。测序鉴定正确后，将M蛋白基因的完整开放阅读框克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒，获得重组穿梭质粒pacAd5-BD06-M；以罗氏转染液介导线性化骨架质粒pacAd59.2-100和重组穿梭质粒pacAd5-BD06-M共转染HEK-293AD细胞，9天后细胞出现典型病变。取培养物进行电镜观察，可见典型的腺病毒样粒子；Western blot检测显示重组腺病毒细胞培养物可与狂犬病病毒BD06株M蛋白多克隆抗体反应，形成约24kD的特异性印迹条带；在HEK-293AD细胞上测定重组腺病毒的平均产毒滴度为1×107.0CFU/mL，比野生型腺病毒的滴度略有下降。重组腺病毒rAd5-BD06-M免疫昆明小鼠，免疫后28天采集血清，进行病毒中和试验，证实该血清不具备病毒中和活性。狂犬病病毒强毒JX08-45CC、弱毒SRV9、街毒BD06株、分别感染BHK-21细胞36h后，表达M蛋白的重组腺病毒rAd5-BD06-M感染HEK-293AD细胞后24h，应用抗狂犬病病毒基质蛋白多克隆抗体进行间接免疫荧光检测,激光共聚焦扫描。结果显示，JX08-45CC、SRV9、BD06株狂犬病病毒的基质蛋白主要存在位于细胞质内和核膜上，而感染重组腺病毒rAd5-BD06-M的HEK-293AD细胞，表达的基质蛋白则主要定位于细胞质和核质内。综上所述，本研究成功构建了表达BD06-M蛋白的复制缺陷型人5型重组腺病毒，并从形态学、病原学、免疫学等方面对获得的重组腺病毒进行了鉴定。不同毒力狂犬病病毒株分别感染BHK-21细胞，其中的基质蛋白主要位于细胞质内和核膜上。而感染重组腺病毒rAd5-BD06-M的HEK-293AD细胞，表达的基质蛋白位于细胞质和核质内。本研究为进一步研究狂犬病病毒基质蛋白的功能奠定了基础。