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目的:特发性弱畸精子症属于临床上常见的男性不育疑难症,其发病机理不明,目前缺乏特效的治疗方法,是临床男科医生十分关注的热点之一。特发性弱畸精子症导致的精液质量下降,直接影响男性生育能力的高低。人类基因组计划的完成使人们意识到大部分的生物学变化发生在蛋白质水平而非基因水平。应用蛋白质组学的研究方法了解疾病状态下的蛋白质表达谱,可发现与疾病相关的一种蛋白质或生物标志物或一组蛋白质;蛋白质组学技术在男性生殖医学领域中的应用却尚属初级阶段,缺少大量有价值的信息和结果。本研究运用蛋白质组学的主要技术之一即双向电泳技术,对观察组特发性弱畸精子症和健康供精者对照组的精液标本进行蛋白质双向电泳后得到差异蛋白图谱,利用蛋白质质谱技术和蛋白质分析软件进行对比分析,进行差异蛋白质功能鉴定,再从差异蛋白的功能去阐述特发性弱畸精子症发病机理。 方法:本研究使用随机数字表法随机选取特发性弱畸精子症患者(90例)和健康供精者(90例)精液标本,分为观察组(特发性弱畸精子症患者)和对照组(健康供精者)。采用尿素盐酸胍裂解法对两组标本进行蛋白质提抽,将提取所得的精子蛋白质,进行双向凝胶电泳(2-DE two-dimensional electrophoresis),对双向电泳所得的蛋白质凝胶进行硝酸银法染色、固定、漂洗和用高分辨率GS-800光密度扫描仪进行扫描,显示精子蛋白质双向凝胶图谱,再利用蛋白质分析软件 PDQuest?2-D Analysis Software对特发性弱畸精子症患者和健康对照组的精子蛋白质做对比观察,找出有差异性的蛋白点,再对差异蛋白点凝胶进行挖点后,送蛋白质谱实验室进行蛋白质质谱鉴定和蛋白质数据库检索、功能鉴定。数据结果采用spss19.0统计软件进行分析。 结果:不同标本之间的双向电泳图谱很相似,将健康供精者精子图谱和特发性弱畸精子症的图谱分别进行匹配,蛋白质平均匹配点数分别为570±169和567±131,平均匹配率为68.2%和62.17%。健康供精者组和特发性弱畸精子症组分别检出共有蛋白质点为938个和998个。两张参考胶的蛋白质点进行匹配,结果显示健康供精者精子和特发性弱畸精子症精子电泳图谱有546个蛋白质点相互匹配。再任意选取同组6块胶中相互匹配且分辨清晰的42个蛋白质点,将位置接近中央的点定为原点,以参考胶为参考位置,测量出其他5块胶对应点在第1向等电聚焦(IEF)和第2向SDA-PAGE方向上的偏差,结果发现两组16块胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性。对健康供精者精子和特发性弱畸精子症精子电泳图中相互匹配的蛋白质点进行差异分析后发现,如果按照5倍的表达量计算,差异点为9个,其中6个点在正常精子中高表达,另外3个点在特发性弱畸精子症精子中高表达;如果按照2倍的表达量计算,差异点为99个,其中51个特发性弱畸精子症精子中高表达,另外49个点在正常精子中高表达。差异显著的蛋白质点经质谱鉴定和蛋白质数据库检索鉴定为,C35,C37;C35的数据库编号为Q9Y5X2,为Sorting nexin-8[SNX8],是一种新的分拣微管连接素,可能参与胞内运输的一些阶段。C37的数据库编号 Q9NQH7,为 PutativeXaa-Proaminopeptidase3[XPNPEP3],是一种氨肽酶,具有水解多肽(甚至二肽)释放 N端氨基酸(包括脯氨酸)的作用。C35,C37蛋白的直接或间接地与特发性弱畸精子症发病相关,影响到精子的数量、形态和功能。 结论:使用的尿素+盐酸胍裂解法裂解法裂解精子含量明显增高,能够满足2-DE电泳的要求上样量;裂解效率高,且方法实用,成本低。本实验初步证实了正常精子与特发性弱精子症患者精子的电泳图谱之间确实存在着表达差异显著的蛋白质点表达。即C35和C37两个蛋白质点。C35直接影响了精子尾部微管结构的形成以及整个精子形态的改变,进而影响精子运动和质量;C37(氨肽酶)是精子成熟、活力、保持正常形态方面的重要因素,与生育力有密切。C35/C37蛋白的高表达可能导致是特发性弱畸精子症的发病原因之一。