磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2）广泛存在于生物体内,参与磷脂分解代谢、激素信号的传递、生物膜的稳衡、动物防御及植物生长发育等生物学过程。然而,PLA2与病原真菌生长发育及侵染致病的关系,鲜有报道。昆虫病原真菌是唯一通过穿透体壁侵染宿主的病原微生物,病原真菌一旦进入昆虫血腔后分化为芽生孢子（虫菌体）以逃避昆虫免疫反应,并分泌一系列的分泌蛋白,降解昆虫组织利用营养和破坏免疫途径,引起致病。课题组前期在解析球孢白僵菌表面蛋白时,发现一些分泌蛋白在虫菌体特异表达。探究这些分泌蛋白与病原菌侵染致病的关系,将有助于揭示病原菌与宿主互作及逃避昆虫免疫的机制。本论文以一个球孢白僵菌虫菌体特异分泌的磷脂酶A2蛋白BbPLA2（Beauveria bassiana phospholipase A2）为研究对象,结合基因表达、分泌特性、基因敲除及超量表达等方法,探究BbPLA2与病原真菌发育分化及侵染致病的关系。主要研究结果如下:1.BbPLA2序列分析、表达和分泌特性BbPLA2编码191个氨基酸,含有典型的信号肽序列（1-15氨基酸）和Phospholip＿A2＿3 super family结构域（38-137位点）,具分泌性磷脂酶A2特有的Ca2+催化结合位点及组氨酸-天冬氨酸（HD）二元结构。系统发育树分析发现,BbPLA2与真菌XIV家族磷脂酶A2聚为一簇。由此表明,BbPLA2为XIV家族磷脂酶A2。表达特性研究表明,BbPLA2在虫菌体中高表达,受昆虫血淋巴诱导表达。融合BbPLA2::GFP基因进行亚细胞定位观察,发现BbPLA2分布于虫菌体脂滴。组成型表达BbPLA2::GFP融合基因发现,BbPLA2分布于分生孢子表面、芽生孢子胞内和表面,而分布在气生菌丝、液生菌丝和虫菌体胞内。Western blot检测表明,BbPLA2可分泌到培养基质。体外表达BbPLA2进行酶活性检测,BbPLA2具有降解卵磷脂活性。由此推测,BbPLA2可能既参加胞内脂滴代谢,也参与降解胞外脂类供真菌利用。2.超量表达BbPLA2促进孢子萌发为揭示BbPLA2与菌株发育分化的关系,分别构建了基因敲除（ΔBbPLA2）、超量表达(BbPLA2OE)及回复互补（Comp）菌株。无论在基础培养基CZA和富营养培养基PDA上,ΔBbPLA2和BbPLA2OE的菌落形态、菌丝生长及分生孢子产生与野生菌株（WT）无明显差异,但超量表达BbPLA2促进了分生孢子萌发,萌发中时比WT缩短了0.9 h。由此表明,BbPLA2参与分生孢子萌发。3.BbPLA2参与菌株脂质积累尼罗红染色观察显示,BbPLA2OE的脂滴含量显著高于WT,推测BbPLA2参与胞内脂滴代谢稳态。体外添加卵磷脂（PC）培养,随培养时间的增加,BbPLA2OE的脂滴积累逐渐增加,而ΔBbPLA2与WT脂滴无明显变化。TAG测定含量显示,尽管PC诱导6 h时,各菌株TAG含量均显著下降,但BbPLA2OE胞内TAG含量显著高于WT。诱导9 h后,BbPLA2OE的TAG含量急剧升高,而ΔBbPLA2与WT的TAG积累仍然受到抑制。RT-q PCR检测发现,PC诱导3 h和9 h后,部分TAG合成相关基因在BbPLA2OE菌株中显著上调。由此推测,BbPLA2可利用外源脂质促进菌株脂质积累。4.破坏或超量表达BbPLA2不影响菌株逆境胁迫反应为探究BbPLA2参与脂质积累与逆境胁迫反应的关系,比较分析了基因破坏和超量表达菌株对高盐、高渗、氧化胁迫及高温的敏感性。结果表明,ΔBbPLA2和BbPLA2OE对这些逆境胁迫的敏感性与WT无明显差异。由此表明,BbPLA2可能不参与逆境胁迫反应。5.超量表达BbPLA2增强菌株毒力利用体壁接种和微量注射两种方法进行生物测定。两种生测结果均表明,超量表达BbPLA2显著提高了菌株毒力,且菌体在昆虫血腔易逃避血细胞包裹,增殖速度显著高于WT,而昆虫血细胞数量则显著低于接种WT。由此表明,BbPLA2既参与菌株穿透体壁,也影响菌株逃避宿主血腔免疫反应。论文研究结果表明,BbPLA2参与胞内脂滴稳态和胞外脂类降解与利用,影响分生孢子萌发和免疫逃避,参与菌株侵染致病。