牙龈是附着在牙颈和牙槽突部分的粘膜组织，呈现粉红色，有光泽，质坚韧，是口腔粘膜的一部分。它担负着牙周组织与口腔环境的粘膜屏障，维持口腔健康。从组织学和功能学上看，由于牙龈具有耐受咀嚼食物所产生的摩擦力的特性，因此它属于咀嚼粘膜，以此和颊侧的被覆粘膜和唇侧粘膜得以区分。牙龈组织由上皮和固有层两部分组成，固有层由颅神经嵴发育而成，与之同源还有颅面其它间充质来源的组织，包括牙乳头和牙周组织。一些文献中报导，大量的颅神经嵴来源的间充质干细胞已经得到证实，它们无论在维持自身内环境稳定上还是在再生治疗中都可以发挥重要的作用。然而，尽管已经确认牙龈来源的细胞是上皮/原始干细胞，但是几乎还没有研究对牙龈来源的细胞鉴定为间充质干细胞。目前一些对牙龈成纤维细胞的研究，认为还不能从其中区分出已经有证据存在的牙龈间充质干细胞。但是近期有文献报导，已经可以成功从人牙龈组织中分离培养出牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cell，GMSC)。这些GMSC无论是在体内环境还是在体外环境都显示出自我更新，多向分化和免疫调节的能力。而这些特征正好与Fournier等人发表的文章中所阐述的牙龈成纤维细胞显示出原始细胞的特性相似，包括体外低密度细胞形成克隆形成率（colony forming unit-fibroblastic，CFU-F）和体内多向分化。当前，各种人的间充质干细胞已经获得认可，并且应用于临床治疗中。早先的实验认为运用分离和培养技术，间充质干细胞几乎可以从人的器官和组织甚至从它们的胚胎中获得。我们知道临床上慢性牙龈炎导致的牙龈增生原因复杂，表现也较不均一，而正畸治疗中出现的牙龈炎性增生属于仅与牙菌斑有关的牙龈病，表型稳定，炎症是其发生发展的最主要原因。并且有研究表明，正畸治疗和未经正畸治疗牙龈炎性增生的发生率是没有统计学差异，和矫治力无关，而与口腔卫生相关，。本课题旨在通过对人正常和牙菌斑导致的炎性增生牙龈的组织学，细胞学观察，探讨它们在原位的组织学特征和存在GMSC干细胞的标记物。然后从这两种牙龈组织中分离培养GMSC：正常牙龈间充质干细胞（gingivalmesenchymal stem cell from normal gingival tissue，N-GMSC）、炎性增生牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cell from inflammation ofgingival hyperplasia tissue，I-GMSC）应用单克隆分离和扩增方法，证明它们都具有克隆形成能力和高度增殖能力，比较N-GMSC和I-GMSC成骨和成脂特性的差异，及其细胞外基质、相关蛋白酶、炎性因子的变化特点。建立炎症微环境这一稳定的系统，研究炎症微环境对牙龈间充质干细胞的影响。初步探讨正畸治疗中牙龈炎性增生的发病机制，为探索新的预防和治疗策略提供理论和实验依据。第一部分人正常牙龈和炎性增生牙龈组织学观察实验一、人正常牙龈和炎性增生牙龈组织学观察采用组织学方法观察正常牙龈和炎性增生牙龈组织学特征。结果表明：正常牙龈组织，呈现粉红色，有光泽，质坚韧。炎性增生牙龈组织，牙龈充血，失去正常的解剖外形，并且红肿增生。炎性增生牙龈HE组织切片显示，其上皮钉突明显，固有层大量淋巴细胞浸润。实验二、人正常牙龈和炎性增生牙龈干细胞特异性标志物的比较采用免疫荧光组织化学方法原位观察两种牙龈组织和细胞爬片。结果发现：正常牙龈组织呈现出的干细胞的筛选标志-1（STROL-1）和早期胚胎糖脂抗-4（stage-specific embryonic antigen4，SSEA-4）含量大于炎性增生牙龈组织，提示N-GMSC和I-GMSC存在各自组织中含量的差异，可能同时也具有骨/脂向分化潜力的差异；炎性增生牙龈组织细胞外基质Ⅰ型胶原（collagen-1，COL-1）含量大于正常牙龈组织，N-GMSC和I-GMSC细胞爬片的结果符合它们所来源的组织免疫荧光组织化学COL-1的染色结果，提示两种组织的细胞外基质含量的差异，可能是造成它们的临床出现的不同表型的原因。第二部分人正常牙龈和炎性增生牙龈间充质干细胞分离、培养和生物学特性的初步研究实验一、N-GMSC和I-GMSC的分离、培养及形态学鉴定两种来源牙龈间充质干细胞的分离、培养及形态学鉴定。采用酶消化法分离培养原代牙龈间充质干细胞。结果表明：离体的牙龈组织包含结构完整的间充质组织，表明本实验使用的方法能够分离出GMSC，它可以迅速贴壁，伸展后细胞形态呈长梭形或三角形。实验二、N-GMSC和I-GMSC体外培养生物学特性检测采用有限稀释法细胞接种于大培养皿中，通过克隆形成率检测，从而明确两种状态来源的牙龈组织中GMSC干细胞克隆形成的差异。流式细胞术（flow cytometric，FCM）分别检测来源于间充质的N-GMSC和I-GMSC表面标志：阳性表达-STRO-1、CD29、CD44、CD90、CD105、CD146；阴性表达-CD34、CD45。检测结果表明：N-GMSC和I-GMSC形成克隆的能力无明显差异，但是在相同时间中N-GMSC克隆个体大于I-GMSC。提示炎症导致的牙龈增生组织中仍然存在间充质干细胞。N-GMSC表达的STRO-1、CD146高于I-GMSC，标志物的表达提示GMSC与来源于其他间充质组织（牙髓）的干细胞具有同源性，并且N-GMSC干细胞表达大于I-GMSC。实验三、N-GMSC和I-GMSC多向分化能力检测采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检测、矿化结节染色、脂滴染色及逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测成骨/成脂相关基因表达的方法，检测了N-GMSC和I-GMSC在体外的分化能力。结果表明：N-GMSC在体外显示了较I-GMSC更高的矿化和成脂能力。提示N-GMSC干细胞能力强于I-GMSC，I-GMSC干细胞能力降低，是因为在炎症微环境中会促使GMSC提前进入瞬时扩增细胞（transit-amplyfing cells，TA）的状态。第三部分炎症微环境对人正常牙龈组织来源的间充质干细胞影响实验一、N-GMSC和I-GMSC增殖差异和以此特性建立体外稳定的炎症微环境。甲基噻唑基四唑检测(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)以及细胞周期(cell cycle，CC)检测明确N-GMSC和I-GMSC增殖能力差异，根据它们的增殖特点，确定用外源性炎性因子：白介素-1（nterleukin-1beta，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）建立体外稳定的炎症微环境的浓度，观察N-GMSC在炎症微环境中凋亡能力的变化。结果表明：I-GMSC增殖能力强于N-GMSC，符合炎性增生牙龈的组织学特点。炎症环境对干细胞的影响是其中的炎性因子对它的影响，外源性炎性因子IL-1β(5ng/ml)和TNF-α (10ng/ml)建立稳定的炎症微环境：MTT检测N-GMSC在IL-1β(5ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)炎性因子作用下增殖最高，符合MTT和细胞周期检测结果显示I-GMSC具有强增殖能力。我们还发现N-GMSC在炎性因子作用下凋亡增加，在成骨诱导分化阶段，凋亡数量都会随着作用时间的延长呈现增多的趋势。实验二、N-GMSC和I-GMSC细胞因子基因表达差异的比较RT-PCR检测N-GMSC和I-GMSC基因表达的差异。结果显示：I-GMSC的基质金属蛋白酶1/2（matrix metalloproteinase1/2，MMP1/2）表达量减少；基质金属蛋白酶抑制剂1/2（metallopeptidase inhibitor1/2，TIMP1/2）、IL-1α/6、COL-1、TNF-α表达量增多。提示是否这些表达变化是GMSC在炎症状态中特有的变化趋势？实验三、N-GMSC和对照组正常牙髓干细胞（normal dental pulp stemcell，N-DPSC）在炎症微环境中细胞因子基因表达的比较RT-PCR检测N-GMSC和对照组N-DPSC在炎性微环境中基因表达。结果显示：N-GMSC在体外炎症微环境中，MMP1/2的表达量变化与TIMP1/2的表达量变化成负相关，即炎性因子作用8h时TIMP1/2表达量最高，而同一时间测定的MMP1/2表达量最低。对照组的N-DPSC： MMP1/2随着炎性因子作用时间，基因表达量逐渐增加，而TIMP1/2基因表达量逐渐减少。提示为GMSC在炎症微环境中MMPs与TIMPs表达变化规律具有其特异性。随着炎性因子的作用时间IL-1α/6、COL-1、TNF-α表达量增加。GMSC表达的IL-1α相对DPSC的要强，而DPSC表达的IL-6相对GMSC的强。提示两种组织来源的干细胞（GMSC、DPSC）在炎症微环境中的表达IL-1α，IL-6表达量的差异，是不是因此造成它们所表达MMPs、TIMPs变化趋势不同的原因呢?所以最终导致牙龈和牙髓在炎症中表现出的不同表型，一个为组织的增生，一个为组织的液化。实验四、N-GMSC、N-GMSC (外源性炎性因子)、N-DPSC、N-DPSC(外源性炎性因子)细胞膜片裸鼠皮下移植的实验研究将N-GMSC、N-GMSC(外源性炎性因子)、N-DPSC、N-DPSC(外源性炎性因子)制成细胞膜片移植入裸鼠皮下，2周后取材。对其进行组织免疫荧光组织化学染色，以探讨组织细胞膜片在体内MMP1、TIMP1表达含量符合体外基因表达的特点。牙龈与牙髓组织在炎症中的表型不相同，它们的干细胞属于组织特异的干细胞，在炎性微环境中它们的MMPs与TIMPs表达量的变化趋势也是不同的。可以认为GMSC在炎症微环境中MMPs与TIMPs表达变化规律具有其特异性，符合临床观察到的牙龈炎性增生，失去正常的解剖外形，牙龈充血，红肿增生。牙髓往往会出现牙髓的液化和坏死的炎性反应。