论文部分内容阅读
鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus, CAV)在世界主要养禽国家广泛分布,是危害养禽业的主要病原体之一。CAV感染可以破坏造血系统,并可使淋巴器官萎缩,导致鸡群免疫抑制,这又经常使感染鸡群并发或继发其它病原体的多重感染,导致巨大经济损失。因此对CAV的系统研究甚为重要,本研究是从CAV的检测方法、流行情况以及流行毒株的基因变异和致病性进行系统的研究。根据GenBank中已经发表的CAV VP1基因的序列,设计合成一对引物,利用PCR技术扩增CAV VP1基因的的核酸片段,利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了CAV核酸探针。通过斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,特异性检测结果表明,该探针能与标准模式株CAV核酸发生特异性杂交,而与对照的SPF鸡、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)、呼肠孤病毒(REOV)核酸杂交反应为阴性,具有较强的特异性。敏感性检测结果表明,该探针对CAV的最低检出量为1 pg核酸,具有较高的灵敏度,显示所制备的核酸探针用于临床病料组织DNA中CAV感染的检测是可行的。本实验收集山东泰安、临沂、莱芜、烟台等8市3个品系、不同日龄发病鸡群的384只病、死鸡的脾脏样品,其中麻鸡105份、肉鸡185份、蛋鸡94份,通过斑点杂交方法检测样品中的CAV核酸,检测结果为,CAV总检出率为27.9%(107/384)。3个品系的鸡的检测结果:麻鸡样品的检出率为37.1%(39/105);肉鸡样品的检出率为31.3%(58/185);蛋鸡样品的检出率11.7%(11/94)。结果显示,麻鸡和肉鸡中CAV感染的检出率显著高于蛋鸡。3个不同日龄段的检测结果:1-20日龄的样品检出率为6.4%(7/110);20-60日龄的样品检出率为45.6%(93/204);60日龄以上的样品检出率为10.0%(7/70)。结果显示,20-60日龄的检出率显著高于1-20日龄和60日龄以上的,而20-60日龄段是疾病的高发阶段。其中,从自山东某商品代肉鸡场20日龄病鸡群表现生长迟缓,疑似鸡传染性贫血病病毒(CAV)感染的脾脏、胸腺、骨髓样品提取DNA,分别经斑点杂交检测为CAV阳性后,其余病料研磨上清经处理后接种7日龄SPF鸡胚和1日龄SPF鸡,提取接种后的鸡胚和SPF鸡的脾脏组织DNA,经斑点杂交验证为阳性,从而成功分离到了一株鸡传染性贫血病毒野毒株,命名为CAV-SDLY08株。用PCR方法分段扩增出CAV-SDLY08基因组的三条部分重叠片段,分别克隆于T载体并进行测序,拼接后得到其全基因组序列。结果表明,SDLY08株基因组全长2298nt,含有三个互相重叠的开放阅读框和一个调控区。将SDLY08全基因与已发表的8个CAV分离株基因组比较,同源性为96.6%-99.0%。CAV的三个编码基因VP1、VP2和VP3所编码的氨基酸均有一定程度变异,以VP1基因编码的氨基酸变异性最大,同源性为96.9%-99.0%将CAV-SDLY08株接种感染1、7、21日龄SPF鸡,研究其致病性。通过口服和肌肉注射两种途径分别感染1、7、21日龄SPF鸡,12天后对每组SPF鸡体重、免疫器官指数和血液指标进行测定。体重增重方面:感染12天后,1、7日龄感染组的体重显著低于对照组(P<0.05),而两不同途径感染组间的差异不显著(P>0.05)。21日龄感染组体增重也低于对照组,但差异不显著(P>0.05),两种感染方式的差异也不显著。免疫器官指数方面:感染12天后,不同日龄的感染均能引起脾脏的肿大,1日龄感染的口服组和注射组与对照组比差异显著(P<0.05)。7日龄和21日龄的与对照组比,差异不显著(P>0.05),且感染途径影响不大。3个日龄感染都能引起胸腺的显著萎缩,且不同的感染日龄和感染方式的实验组与对照组相比差异都极显著(P<0.01)。血液指标方面:感染12天后,可引起白细胞数量的减少,1日龄感染的口服组和注射组与对照比差异极显著(P<0.01)。7日龄和21日龄,注射组显著低于口服组和对照组(P<0.05),口服组和对照组差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,CAV感染都能引起红细胞数量的显著减少(P<0.01),口服组和注射组与对照组相比差异极显著(P<0.01),且两种感染方式之间差异显著(P<0.05)。与对照组相比,都能引起红细胞压积的显著减少(P<0.01),1日龄和7日龄感染的口服组和注射组差异极显著(P<0.01),21日龄差异显著(P<0.05)。综合结果显示, CAV-SDLY08株感染三个日龄SPF鸡12天后,均可导致增重减缓、胸腺显著萎缩、脾脏肿大、白细胞数、红细胞数与红细胞压积的显著减少。这表明该CAV-SDLY08分离株对1日龄和7日龄鸡的致病性要强于21日龄,肌肉注射比口服感染组的致病性更强。而且结果同时表明,该毒株对21日龄的SPF鸡仍有明显的致病作用。