羊痘(Capripox)是由羊痘病毒(Capripoxvirus)引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病,被世界动物卫生组织列为必须报告的动物疫病。羊痘病毒为痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员,包括绵羊痘病毒(Sheeppox virus)、山羊痘病毒(Goatpox virus)和牛结节性疹块病病毒(Lump skin disease virus)。干扰素(IFN)诱导的双链RNA依赖的蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)是哺乳动物4种丝氨酸/苏氨酸激酶之一(其他3个分别为HRI,GCN2和PERK),它能够识别细胞应激和病毒感染,并作用于真核起始因子eIF2α,使其发生磷酸化,从而抑制病毒蛋白的合成。羊痘是动物痘病中十分严重的一种,目前关于PKR对羊痘病毒作用的研究甚少。本研究通过检测绵羊痘病毒(SPPV)感染后细胞内PKR-eIF2α的变化,检测过表达及通过RNA干扰技术下调PKR蛋白表达后对SPPV复制的影响,验证SPPV K3L蛋白与PKR之间的相互作用,旨在综合评价PKR在细胞抗羊痘病毒复制中的作用。1、SPPV感染后对细胞内PKR-eIF2α的影响的研究。SPPV感染HeLa细胞,通过Western-blot方法检测细胞内PKR及eIF2α蛋白水平及其磷酸化水平的变化,结果表明:SPPV感染能够引起PKR及eIF2α磷酸化水平明显升高,且具有剂量相关性,而经过紫外灭活的SPPV未能激活PKR通路。说明PKR的激活需要SPPV在细胞内的复制,复制过程中产生的dsRNA是PKR的活化剂。2、细胞感染SPPV后PKR的作用研究。为了验证PKR在细胞感染SPPV后的作用,本研究进行了PKR过表达或利用RNA干扰技术下调PKR蛋白表达,接种SPPV GL毒株后检测病毒蛋白的表达及SPPV的复制。结果发现:在PKR过表达的HeLa细胞中,SPPV GL毒株病毒的复制水平比对照组细胞降低,病毒蛋白表达下降;而PKR沉默则促进了病毒的复制。证明PKR对细胞内的SPPV复制有抑制作用。3、PKR在SPPV感染过程中诱导干扰素的产生的研究。本试验通过实时荧光定量PCR检测PKR下调后接种SPPV细胞内IFN-βmRNA水平。结果显示:与对照组相比,PKR蛋白表达下调的细胞中,IFN-βmRNA水平显著降低,证明PKR能够诱导IFN-β的产生。4、PKR与羊痘病毒K3L蛋白作用关系的研究。痘苗病毒的K3L蛋白在结构上与PKR的自然底物eIF2α相似,可作为“假底物”与PKR结合,从而抑制PKR的作用。为了确定羊痘病毒的K3L蛋白是否也与PKR存在相互作用,本研究通过间接免疫荧光和免疫共沉淀试验证明了羊痘病毒K3L蛋白与细胞内的PKR重合表达,且蛋白定位在细胞核,并通过Western-blot方法确定了两者存在相互作用。通过相对荧光定量PCR方法,还确定了在羊痘病毒感染细胞过程中羊痘病毒K3L基因能够在短时间内快速大量的复制,这可能与病毒在细胞内的进一步复制增殖有关。