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胆固醇7α-羟化酶(Cholestrol7α-Hydroxylase,CYP7A1)又称胆固醇7α-单氧酶或细胞色素P4507A1酶,属肝脏特异性微粒体细胞色素P450酶系,该酶位于肝细胞内质网膜上,作用是催化胆固醇生成7α-固醇,后者经过固醇核还原、羟化、侧链断裂和加辅酶A等反应生成初级胆汁酸,同时CYP7A1也是此途径的限速酶。大量研究证明,胆固醇-胆汁酸平衡对机体健康具有重要作用,血液胆固醇水平过高会引起高胆固醇血症、动脉硬化、胆结石等疾病,而胆汁酸水平过高则可能会导致胆囊癌、结直肠癌的发生。CYP7A1基因自身多态性、多种核受体、细胞因子、激素共同组成了CYP7A1基因表达的转录激活/抑制级联网络,维持体内胆汁酸-胆固醇平衡及脂质动态平衡。目前该基因在畜禽领域的研究还不够深入,尤其是在转录水平的研究较少。有研究表明,CYP7A1基因表达和P53蛋白在肝脏细胞增殖、脂肪变性及细胞凋亡等过程中可能存在某种协同关系。本研究以鹅为实验对象,成功地克隆了CYP7A1基因启动子区序列,并初步探索了该序列上P53蛋白的结合位点,以及P53蛋白对CYP7A1基因的调控作用。
本实验利用基因组步移技术,首次从鹅基因组DNA克隆到CYP7A1基因5调控区序列,长为2004bp。利用在线软件对所得序列结果进行了序列分析,预测了启动子功能区和转录调控结合位点,其中P53的结合位点有6处。
本研究根据CYP7A1基因5调控区序列成功克隆了一组缺失突变体,将缺失突变体构建重组双荧光素酶报告基因表达载体pGL系列,通过脂质体转染法将重组质粒和pTK-Renilla质粒以及P53真核表达质粒p3XFLAG-P53质粒/空白质粒pET-His质粒共同转入DF-1细胞中,检测不同重组质粒的报告基因表达效率,从而初步确定P53在CYP7A1基因5调控区的结合位置和调控作用。