Grave’s病(GD)又称毒性弥漫性甲状腺肿,是一种器官特异性自身免疫性疾病,是由于细胞表面促甲状腺激素(TSH)的受体作为自身抗原所产生的相应抗体(TRAb)与TSH受体结合,甲状腺细胞活化而引起的甲状腺机能亢进。主要表现为:弥漫性甲状腺肿伴甲亢症状、浸润性突眼、胫前黏液性水肿以及产生特异性的甲状腺刺激性抗体(TRAb)。GD的免疫功能异常表现为:甲状腺滤泡细胞(TFC)通过其表面异常表达的免疫活性分子与自身反应性T淋巴细胞相互作用,诱导抗原特异性T淋巴细胞向组织局部聚集、活化、增生、分化为功能性T细胞,分泌多种细胞因子,介导免疫损伤;同时促进B细胞分化,产生多种针对甲状腺组织的特异性自身抗体,最终导致腺体结构和功能发生变化。但其自身抗体产生的确切机制至今尚未阐明。近年来,自身反应性T细胞的发现以及协同刺激分子在GD患者自身抗体产生中的作用越来越受到人们的重视。大量的研究发现,外周血淋巴细胞亚群的变化及其表面协同刺激分子的异常表达与GD自身抗体的产生及疾病的发生密切相关。已有的研究表明:(1)很多自身免疫性疾病中均存在着CD4~+CD28-T细胞这一特殊的细胞群体,由于这群自身反应性T细胞的异常活化而导致了疾病的发生和发展;(2)在自体T细胞和PWM共同作用下,GD患者外周血B淋巴细胞可以分泌多于对照组4倍的IgG,而在缺乏自体T细胞时,IgG的分泌未见显著增加;(3)在GD小鼠模型中,TRAb仅在野生型的小鼠外周血中被检测到,而在B细胞缺陷的小鼠模型中,不能检测到自身抗体的产生。由此提示:GD患者自身抗体的产生与T、B细胞之间的相互作用密切相关,而其表面异常表达的协同刺激分子很可能发挥了非常重要的作用,但是其确切的免疫机制尚不清楚。ICOS是1999年,Hutloff等学者首先在活化的T细胞上发现的,其结构和功能与CD28十分相似,是CD28家族的第三个成员,但其只能诱导表达于活化的T细胞表面或记忆性T细胞表面,故命名为ICOS(Inducible Costimulator,可诱导的共刺激分子),因其缺乏MYPPPY基序,由此推断ICOS应该有其特异性的配体。同年,Yoshinaga和他的同事首先报道了小鼠的B7RP-1分子,并证实B7RP-1就是ICOS的特异性配体。人ICOS的配体ICOSL(又称为hB7RP-1,B7-H2,hLICOS)主要高表达于活化的B细胞,在巨噬细胞和树突状细胞表面也有表达。先前的研究发现TNF-α可以诱导小鼠成纤维细胞或一些非淋巴组织表达ICOSL;IL-1β和TNF-α可显著上调内皮细胞表面ICOSL的表达;ICOSL在细胞和组织上的表达受到多种细胞因子的调控。ICOS-ICOSL信号在机体的免疫反应调节中发挥重要的生物学效应:(1)ICOS分子上调性表达于活化的T细胞表面,与其配体ICOSL分子的结合能够促进T细胞的活化和增殖,从而协同CD28-B7信号在机体免疫应答中发挥重要的调节作用。而与CD28-B7不同的是,ICOS-ICOSL信号不能上调活化T细胞表达IL-2,但可以诱导IL-10的高表达,从而促进Th2的极化。由此可见,ICOS-ICOSL信号通路不依赖CD28-B7信号,两者可能是机体相互独立的信号途径。(2)ICOS-ICOSL信号参与体液免疫应答。ICOS-ICOSLL信号虽然不影响B细胞的发育,但却是机体B细胞分化成熟的重要信号,该信号的缺乏将导致机体T细胞依赖性的B淋巴细胞反应严重受损。在体液免疫应答过程中,ICOSL分子的表达参与了T淋巴细胞和B淋巴细胞的“相互对话”(Cross-talk);ICOS-ICOSL信号通过促进活化B细胞的增殖和抗体的分泌,从而参与了机体体液免疫应答的重要调节。(3)由于ICOSL能在一些非淋巴细胞上诱导表达,故ICOS-ICOSL信号在局部的免疫应答和炎症反应中亦具有重要功能。鉴此,ICOS/ICOSL信号很可能参与了GD的免疫致病过程。本项目拟在检测GD患者外周血及甲状腺组织中ICOS/ICOSL分子的异常表达及临床意义的基础上,进一步探讨ICOS-ICOSL信号在甲状腺机能亢进免疫病理过程中的作用及机制。第一部分ICOS/ICOSL分子在Graves病患者外周血淋巴细胞亚群上的异常表达及其临床意义【目的】检测GD患者外周血中CD4~+CD28~-T细胞的数量和ICOS/ICOSL分子在淋巴细胞亚群上的异常表达,分析其与患者检测指标、临床疗效及复发性之间的相关性;检测GD患者外周血血清中不同细胞因子的分泌。【方法】选择105例GD患者外周血单个核细胞(PBMCs)作为实验对象,同时选取67例健康人外周血PBMCs作为正常对照。通过流式细胞术检测GD患者外周血中淋巴细胞亚群的异常变化,通过流式细胞术和real-time PCR的方法,从分子和基因两个不同水平检测ICOS/ICOSL分子在健康人和GD初发患者以及同一GD患者治疗前后外周血PBMCs淋巴细胞亚群表面的表达特性;通过统计学方法分析自身反应性T细胞(CD4~+CD28~-T细胞)的增加、ICOS/ICOSL分子在淋巴细胞上的异常表达与患者临床检测指标、疗效和复发性之间的相关性;并用real-time PCR和酶联免疫反应技术(ELISA)检测患者外周血中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17等细胞因子的分泌。【结果】①GD患者外周血中CD4~+T细胞显著减少(P<0.05),CD4/CD8显著降低(P<0.05),CD19~+B细胞数量显著增加(P<0.001),T细胞表面CD28分子的表达显著下降(P<0.01),进一步双标后发现,CD4~+CD28~+、CD8~+CD28~+百分率均显著下降(P<0.05, P<0.01);②与健康人外周血相比,GD初发患者外周血中CD4~+T细胞表面ICOS呈上调性表达(P<0.001),在CD8~+T细胞表面未见显著异常;而CD19~+B细胞上ICOSL分子的表达显著增加(P<0.0001);③real-time PCR结果显示,GD患者外周血中ICOS和ICOSL mRNA水平均显著高于健康人;④与健康人相比,GD患者外周血中sIL-2减少,而sIL-4、sIL-6、sIL-10、sIFN-γ、sTNF-α、sIL-17显著增加。⑤同一患者治疗缓解后,与治疗前相比,自身反应性T细胞显著减少,CD4~+T细胞表面ICOS的表达和CD19~+B细胞表面ICOSL的表达均显著降低;⑥自身反应性T细胞的数量和CD4~+T细胞表面ICOS分子的表达均与患者外周血血清中FT3正相关,而与FT4和TSH无显著相关性;⑦与低TRAb组相比,高TRAb组患者外周血中自身反应性T细胞的数量和CD19~+B细胞表面ICOSL的表达均显著增加。【结论】GD患者外周血中存在高比例的自身反应性T细胞(CD4~+CD28~-T细胞),ICOS/ICOSL分子异常表达于GD患者外周血PBMCs的不同亚群表面,并与疾病临床特征相关,提示ICOS-ICOSL协同刺激信号参与了GD患者的免疫病理机制。第二部分ICOS/ICOSL分子在GD患者甲状腺组织中的表达【目的】检测ICOS/ICOSL分子在GD患者甲状腺组织中的表达,分析相关细胞因子对甲状腺滤泡细胞表面ICOSL分子表达的调节。【方法】选取GD患者手术切除的甲状腺组织标本作为研究对象,同时以非毒性甲状腺肿(NTG)和桥本氏甲状腺炎(HT)患者的甲状腺组织为对照。应用流式细胞术、real-time PCR、免疫组化染色方法(IHC)和激光共聚焦显微镜技术(confocal)检测ICOS/ICOSL分子在GD和NTG甲状腺组织细胞、浸润性T、B淋巴细胞表面的表达。运用甲状腺细胞原代培养技术和流式细胞术,检测各种细胞因子刺激后,甲状腺滤泡细胞表面ICOSL分子的表达变化。【结果】①与HT和NTG的甲状腺组织相比,ICOS/ICOSL mRNA在GD甲状腺组织中异常高表达;②流式细胞术检测结果显示:GD患者甲状腺组织中浸润的淋巴细胞表面表达了ICOS/ICOSL分子;③免疫组织化学染色结果显示:GD患者甲状腺组织中浸润的T淋巴细胞表面ICOS呈阳性表达,而浸润的B细胞以及TFC表面ICOSL呈阳性表达。而HT和NTG组织中仅见浸润B细胞表面表达ICOSL。④TFC在体外经细胞因子(IL-6、IFN-γ、TNF-α)刺激培养3d,其表面协同刺激分子ICOSL呈上调性表达。【结论】ICOS/ICOSL分子异常表达在GD患者局部组织中,介导的协同刺激信号促进Th2细胞的极化,辅助B细胞活化并产生大量的自身抗体,大量促炎因子的分泌促进了TFC表面ICOSL的表达,进一步诱发、维持和加重甲状腺的自身免疫。第三部分ICOS-ICOSL信号对原代培养的甲状腺上皮细胞生物学行为的影响【目的】探讨ICOS-ICOSL协同刺激信号对原代培养TFC生物学特性的影响。【方法】运用甲状腺细胞原代培养技术、MTT法和放免法,利用ICOS/L929基因转染细胞和阻断型ICOSL抗体,体外研究ICOS-ICOSL信号对原代培养的TFC的增殖、合成甲状腺素FT3、FT4和分泌甲状腺球蛋白(Tg)能力的影响。【结果】ICOS基因转染细胞(ICOS/L929)与空载体基因转染细胞(mock-L929)相比,能明显促进TFC的体外生长,促进合成甲状腺素FT3和FT4和分泌甲状腺球蛋白Tg,P值均<0.01。加入阻断型ICOSL抗体后,TFC分泌的甲状腺激素FT3、FT4以及甲状腺球蛋白Tg显著减少,P值均<0.05;【结论】T细胞表面的ICOS分子与TFC表面表达的ICOSL分子相互作用介导的协同刺激信号,具有促进滤泡细胞的生长和功能的作用。综上所述,本课题通过流式细胞术、PCR等技术,检测GD患者外周血中CD4+CD28~-T淋巴细胞(自身反应性T细胞)的增加以及ICOS/ICOSL分子在外周血淋巴细胞亚群和局部甲状腺组织中的表达特性,分析其异常表达与患者临床疗效和复发之间的相关性;并进一步采用体外实验验证ICOS-ICOSL信号对GD患者TFC生物学行为的影响,从而阐明在TFC、自身反应性T细胞和B细胞形成的微环境中,ICOS/ICOSL协同刺激信号发挥的激发、维持和放大免疫效应的作用。这对进一步了解ICOS-ICOSL信号的免疫调节功能,深入阐明GD的免疫致病机理,以及寻找具有潜在临床应用价值的免疫干预手段具有重要意义。