D-塔格糖是一种己酮糖,在自然界中存在较少,为稀有糖。D-塔格糖的甜度可达蔗糖的92%,但提供的能量仅为蔗糖的1/3,可作为蔗糖的替代品。目前,一般通过L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖生产D-塔格糖。这一反应中,温度和p H是重要影响因素。因此,大多数研究更关注由嗜热菌或极端嗜热菌中获取的L-阿拉伯糖异构酶。同时,尝试通过分子改造技术降低耐热酶的最适反应p H值并提高酶活性。耐热菌Alicyclobacillus hesperidum URH17-3-68中编码L-阿拉伯糖异构酶（L-AI）的基因片段,在NCBI中的编码为URH17368₀701。利用DNAMAN对基因序列分析,结果显示基因URH17368₀701全长1497 bp,编码498个氨基酸。其编码蛋白的理论分子量为56,207 Da,蛋白在Gene Bank数据库中的登录号为EJY56736.1。通过基因合成技术合成目的基因片段,连接至p ET-22b（+）表达载体,形成重组质粒。将其转化至感受态细胞E.coli BL21（DE3）中,使用IPTG诱导蛋白过量表达,然后将重组酶经热处理及DEAE阴离子交换柱纯化,并对纯化后的酶进行SDS-PAGE。检测发现,纯化后的A.hesperidum L-AI在约56 k Da处出现特征蛋白条带,这与理论推测分子量相一致。研究酶学性质发现,重组酶的最适反应p H为7.0,最适反应温度为70°C。该酶有较宽的p H作用范围（p H 5.5⁷.0）,并且在此p H范围内稳定性较好。该酶为离子依赖型酶,Co2+和Mn2+均能显著提高酶活,Co2+的催化效果更强。该酶在65°C以下热稳定性较好,而温度达75°C时,Co2+能够显著提高酶的热稳定性。当以D-半乳糖或L-阿拉伯糖为反应底物时,测得该酶动力学参数Km分别为:54.7 mmol/L和105.2 mmol/L。为获得酶活提高且最适p H降低的L-AI,通过定向进化对酶分子进行改造。采用易错PCR技术,构建突变体库,筛选获得酶活提高的正向突变体D478N。随后,采用定点突变技术,在478位构建突变体D478Q、D478A、D478K和D478R。将获得的突变体酶进行分离纯化及性质的测定。研究突变体酶学性质发现,5个突变体酶的最适温度均在60°C以上;除了D478A,其他突变体的最适p H均下降,在p H 6.0⁶.5范围内。所有突变体均需Co2+或Mn2+促进酶活的表达。测定发现突变体D478N和D478Q对D-半乳糖的催化效率高于野生型L-AI。在酸性环境下（p H 6.0）,测定D478N、D478Q及野生型酶催化D-半乳糖异构化,实验结果显示D478N和D478Q对D-半乳糖的平衡转化率明显高于野生型酶。以大肠杆菌L-AI晶体结构为模板,模拟获得A.hesperidum L-AI的结构模型。模型显示478位氨基酸位于酶分子表面,推测其带电状态会影响底物与酶结合或异构化反应的最适p H。但对于478位的氨基酸如何影响酶的最适p H及其活力,还需对酶的晶体结构及其与底物的结合情况做进一步研究。