抗猪瘟病毒疫苗效力免疫监测方法的建立及应用

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猪瘟是一类有传染性的猪类疾病,经常给养猪业造成巨大的经济损失。用猪瘟疫苗免疫猪是控制猪瘟的常用手段。不同厂家,不同批次的猪瘟疫苗常产生不同的免疫效果,而E2蛋白是诱导机体产生中和性抗体的主要抗原表位,也是多种疫苗研究的主要目标蛋白,为了解猪瘟疫苗免疫后猪瘟抗体的产生情况以及猪场生产实践中对不同猪瘟疫苗进行评价,需要建立一种猪瘟疫苗免疫效力的监测方法。本研究通过PCR扩增了石门株猪瘟病毒基因组上开放性阅读框内的2455bp~3016bp之间的片段并克隆到原核表达载体PET-32a中,构建原核表达质粒PET32a-mE2。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21中,经过SDS-PAGE电泳分析表明mE2蛋白主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中,在37℃条件下用0.1mM IPTG诱导表达3h。mE2蛋白用8M尿素变性处理后用Ni-NTA柱纯化,纯化后用6M尿素,4M尿素,2M尿素,1M尿素,0.5M尿素,PBS进行梯度透析,复性mE2蛋白。用BCA法测蛋白浓度为152ug/ml。将纯化的蛋白作为包被抗原包被ELISA板,建立检测猪瘟抗体的间接ELISA法,并摸索最佳反应条件。OPD室温避光显色15min,2M硫酸终止反应。用酶标仪测定OD450值。当待检血清OD450值大于0.222确定为阳性血清,对建立的间接ELISA法进行批内重复性实验,结果显示重复性良好。分别测定PRV,PCV2阳性血清,进行特异性检验,结果表明此种方法特异性良好。利用此方法对92份血清进行样本测定,与IDEXX猪瘟抗体检测试剂盒测定结果比对,符合率为84%。应用此方法分别对一个厂家的脾淋源猪瘟活疫苗与三个厂家的细胞源猪瘟活疫苗免疫过的120头仔猪的免疫效果进行评价。发现脾淋源猪瘟活疫苗的免疫效果要优于细胞源猪瘟活疫苗,三个厂家的细胞源猪瘟活疫苗产生的抗体阳性率基本一致,但是产生的抗体效价不同。证明建立的间接ELISA法可以应用于猪瘟疫苗的免疫效力监测,为猪瘟抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。
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