研究目的肠道是机体内环境与外界直接交流的主要界面。肠道黏膜免疫系统是机体抵御肠道病原体感染的第一道防线。小肠固有层是肠道免疫系统主要的效应位点,其中包含大量的巨噬细胞、CD4+T细胞和树突状细胞等,在早期抵抗肠道病原菌过程中起着关键作用。其中巨噬细胞通过产生活性氧中间体和活性氮中间体等物质,在清除胞内寄生菌的过程中发挥关键的杀菌作用。CD4+T细胞可以通过分泌IFN-γ促进巨噬细胞的活化,但在肠道黏膜免疫系统抵抗外来病原体感染的过程中,二者是否存在相互调节及其在抗感染中的作用和机制,目前研究尚少。本研究以鼠伤寒沙门氏菌肠道感染模型,观察小肠固有层巨噬细胞和CD4+T细胞的活化及其在抗细菌感染中的作用,并探讨二者间是否存在相互调节作用及机制,将为肠道感染及炎症修复等疾病提供新的治疗策略和思路。方法：首先,我们采用灌胃的方法建立了肠道感染鼠伤寒沙门氏菌动物模型；运用流式细胞术检测小鼠小肠固有层淋巴细胞各亚群的比例、数量和活化的变化。其次,为了研究肠道巨噬细胞和CD4+T细胞在抵抗外来病原菌入侵时是否存在相互调节作用,我们分别利用特异性清除抗体清除小鼠CD4+T细胞、利用C12MDP脂质体清除巨噬细胞,观察清除CD4+T细胞对感染小鼠巨噬细胞数量和活化的变化及清除巨噬细胞对感染小鼠CD4+T细胞的数量和活化的变化。再次,我们分离小鼠腹腔巨噬细胞,体外感染鼠伤寒沙门氏菌后,与CD4+T细胞共孵育,同时加入α-乳糖特异性阻断galectin-9与Tim-3的结合,然后观察巨噬细胞的载菌量、活化、分泌细胞因子水平和CD4+T细胞的活化、分泌细胞因子、凋亡的变化。最后,我们运用Western blot技术检测小鼠腹腔巨噬细胞体外感染鼠伤寒沙门氏菌后炎性小体NLRP3和NLRC4以及caspase-1的蛋白表达水平,利用Western blot、ELISA和FACS等多种技术检测IL-1β的表达变化。另外,我们观察了加入IL-1p中和抗体后感染的巨噬细胞与CD4+T细胞共孵育后的载菌量变化及外加IL-1p对感染后的小鼠腹腔巨噬细胞载菌量和galectin-9表达的影响。初步探究了galectin-9和Tim-3信号通路在巨噬细胞和CD4+T细胞之间的相互作用中所发挥的作用。结果：1.小肠固有层F4/80+CD11c+巨噬细胞和CD4+T细胞在感染后数量和活化均明显增加我们我们首先建立了鼠伤寒沙门氏菌肠道感染模型,并应用流式细胞术检测了感染第1、3、5、7天小肠固有层部位各淋巴细胞亚群的比例、数量和活化的变化。结果发现随着感染天数的增加,小肠固有层F4/80+CD11b+巨噬细胞的比例有所增加。有趣的是,我们发现一群表型为F4/80+CD11c+的巨噬细胞,其在固有层中的比例和数量的增加更为明显。同时我们也观察到了CD4+T细胞和CD8+T细胞在感染后数量增加,但仅有CD4+T细胞活化明显增强。提示这两种细胞在清除鼠伤寒沙门氏菌的过程中发挥重要作用。2.清除CD4+T细胞明显削弱小肠固有层巨噬细胞的活化我们通过抗体清除实验清除小鼠CD4+T细胞,然后比较清除组和未清除组感染后小肠固有层巨噬细胞的数量及活化的变化。结果发现,清除CD4+T细胞小鼠感染后肝、脾、MLN组织载菌量高于未清除组,肠道巨噬细胞的活化和IL-1β的分泌均低于未清除组。3.清除巨噬细胞明显削弱小肠固有层CD4+T细胞的活化我们利用C12MDP脂质体清除小鼠巨噬细胞,然后比较清除组和未清除组感染后小肠固有层CD4+T细胞的数量及活化的变化。我们发现,清除组小鼠感染后肝、脾、MLN组织载菌量高于未清除组,肠道CD4+T细胞的活化和细胞因子分泌均低于未清除组。4.α-乳糖阻断galectin-9-Tim-3的结合影响巨噬细胞的杀菌功能为了验证galectin-9和Tim-3信号通路参与了肠道巨噬细胞和CD4+T细胞之间的相互作用,我们在巨噬细胞和CD4+T细胞体外共孵育实验中加入不同浓度α-乳糖以阻断galectin-9与Tim-3的结合,发现随着α-乳糖浓度的升高巨噬细胞的载菌量和IL-1p的分泌均明显下降；而CD4+T细胞的活化没有受到明显影响,但其凋亡随着α-乳糖浓度的升高而降低。提示galectin-9和Tim-3信号通路参与了肠道巨噬细胞和CD4+T细胞之间的相互作用,而且这一信号通路促进巨噬细胞的杀菌功能、触发CD4+T细胞的凋亡。5.巨噬细胞感染鼠伤寒沙门氏菌后细胞因子和炎性小体及其下游信号分子的表达上调对小鼠腹腔巨噬细胞体外感染鼠伤寒沙门氏菌后各种指标的检测证明,巨噬细胞感染后IL-1p的分泌量增多,炎性小体NLRC4和NLRP3及caspase-1的表达量增加,并且自感染6小时即明显增加,至18小时达到高峰,24小时略有下降。6.α-乳糖阻断galectin-9-Tim-3的结合影响巨噬细胞炎性小体NLRC4和NLRP3及caspase-1的表达在巨噬细胞和CD4+T细胞共孵育体系中加入不同浓度a-乳糖,检测巨噬细胞中炎性小体及其下游信号分子的表达。结果显示,感染鼠伤寒沙门氏菌可以激活炎性小体的表达；再加入CD4+T细胞共孵育,可进一步提高炎性小体的表达水平；当加入不同浓度的a-乳糖后,随着乳糖浓度的升高炎性小体的表达呈现逐步下降的趋势。说明galectin-9-Tim-3的结合可以促进巨噬细胞表达炎性小体及其下游信号分子。7.IL-1β促进巨噬细胞的杀菌能力和galectin-9的表达小鼠腹腔巨噬细胞体外感染鼠伤寒沙门氏菌后加入不同浓度IL-1p刺激,观察巨噬细胞载菌量的变化。发现随着IL-1p浓度的增加,巨噬细胞的载菌量逐渐下降。感染的巨噬细胞与CD4+T细胞共孵育,同时加入IL-1p中和抗体,发现中和抗体的加入明显削弱了巨噬细胞清除细菌的能力。而加入10ng/mL的IL-1β培养后,FACS检测巨噬细胞表达galectin-9的变化。结果显示,IL-1β可以促进巨噬细胞galectin-9的表达,而且培养18小时较12小时时增加更加明显。结论：1.小肠固有层F4/80+CD11c+巨噬细胞和CD4+T细胞在肠道免疫系统清除胞内菌的过程中发挥重要作用。2.小肠固有层巨噬细胞和CD4+T细胞在清除病原菌过程中存在相互作用。3. Galectin-9-Tim-3信号通路参与了肠道巨噬细胞和CD4+T细胞之间的相互作用。4. Galectin-9-Tim-3信号通路可以增强巨噬细胞炎性小体的表达及IL-1p的成熟和分泌。5.IL-1β通过自分泌的形式促进巨噬细胞的杀菌功能。