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文章从以下三部分就精浆游离microRNA的稳定性及作为男性不育标志物的初步探索进行了综述。 第一部分精浆游离microRNA的分离纯化 目的:精浆中含有大量游离miRNA,有可能成为男性不育的新标志物,由于精浆成分复杂,富含蛋白和多糖等物质,一般的提取RNA的方法不适于精浆游离miRNA的分离,因此建立一种有效提取人精浆RNA的方法以用于精浆游离 miRNA的分析是十分必要的。 方法:收集精液参数正常的男性精液标本,根据精浆中富含蛋白和多糖的特点在加入Trizol LS Reagent前先用低浓度蛋白酶K消化以去除精浆中的蛋白,然后再加入PEG20000以去除多糖及其它成分。通过紫外分光法测定RNA的纯度,然后再通过荧光定量PCR对3种精浆中大量存在的miRNA(miR-34a, miR-141,miR-449a)进行分析。 结果:改良Trizol LS法获得的RNA纯度好,产量高。紫外分光法测定OD260/28均接近于1.8(不改良的Trizol LS法约为1.3);结果证实该种方法提取的RNA可以用于miRNA的定量分析。 结论:改良Trizol LS法是一种从人类精浆中提取RNA的高效、可靠的方法,这为进一步研究精浆中游离miRNA的一般特征及其与男性生殖系统疾病的相关性奠定了基础。 第二部分精浆游离microRNA的稳定性 目的:由于游离miRNA有望成为一种诊断的新标记物,所以在疾病诊断中越来越受到人们的重视,研究精浆中游离miRNA的稳定性是否满足分子检测技术的基本要求是必要的。本部分的完成将为进一步研究病理情况下精浆中游离miRNA及其在临床中的应用奠定实验基础。 方法:收集精液参数正常和输精管结扎的男性精液标本各5份。为分析精浆中游离miRNA的稳定性,离心后各留取精浆1ml在室温下孵育,分别于0h,2h,4h,8h和24h5个时间点取出200μl,通过real-time PCR对精浆中4种miRNA和2种piRNA进行定量分析。同时选取5份输精管结扎的男性精液标本(不含睾丸来源的piRNA)作为对照以证明精浆中RNase的活性,离心后各留取精浆1ml,再将从精液参数正常人精浆中纯化的cfs-miRNA(含piRNA)加入其中,然后在室温下孵育,分别于0min,2min,5min,10min和2h5个时间点取出200μl,最后对睾丸特异性的2种piRNA(只存在正常人精浆中,不存在于输精管结扎的精浆中)进行定量分析。 结果:经过在室温下孵育之后,精浆中内源性游离miRNA(miR-34a, miR-141, miR-202, miR-449a, piR-013423, piR-023386)的产量直到24h时均无变化(P>0.05),而纯化之后再加入到输精管结扎者精浆中的外源性miRNA在室温下孵育仅2min时大部分都已经降解(piRNA-013423和piRNA-023386分别剩余11.7％,12.3％),从而证明精浆中RNase的活性。 结论:精浆中内源性游离miRNA很稳定,能够通过某种机制逃脱RNase的作用而不被降解,这是其作为标志物的重要特征。 第三部分精浆游离microRNA作为男性不育新标志物的探索 目的:游离miRNA在肿瘤、心血管疾病、组织损伤、妊娠等生理病理过程中表达失调,是一种很有前景的新分子标志物。我们前面的实验证实精浆中游离miRNA很稳定,能够逃脱RNA酶的作用而不被降解。我们推测睾丸、附睾来源的游离miRNA可能与精子发生、成熟密切相关,在某些特发性男性不育,如特发性少精子症、弱精子症、无精子症等患者中表现出一种失调的状态,而这种失调可以通过定量分析 cfs-miRNA得到反映。本实验以特发性严重少精子症为研究对象,对这一推测进行探索。 方法:收集18例精液参数正常和17例特发性严重少精子症的男性精液,通过荧光定量PCR检测来源于睾丸的游离miRNA(miR-202, miR-509-3-5p, miR-425, miR-504, miR-508-3, piR-514)和普遍表达的miRNA(miR-30d, let-7d)在严重少精子症和正常人精浆中表达的差异性。 结果:3种来源于睾丸的游离miRNA(miR-202, miR-509-3-5p, miR-504)在特发性严重少精子症的精浆中表现为明显的下调,差异有显著性意义(P<0.05);而另外3种来源于睾丸的游离miRNA(miR-425, miR-508-3p, miR-514)和let-7d在两种精浆标本中没有明显的差异,差异无显著性意义(P>0.05)。 结论:来源于睾丸的miRNA(miR-202, miR-509-3-5p, miR-504)与精子发生密切相关,它们的下调可能是导致精子数量减少的又一分子遗传学病因,也可能是其它不利于精子发生病因的中间作用环节。cfs-miRNA可望成为无创性分析部分男性不育表观遗传病因和机制的新分子标志物。