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背景内脂素(visfatin)是由内脏脂肪细胞高表达的一种脂肪细胞因子,与先前在淋巴细胞中发现的一种称为前B细胞克隆增强因子(PBEF)的蛋白结构一致,具有广泛的生物学效应。visfatin主要来源于脂肪组织中的巨噬细胞,同时在骨髓基质细胞、活化淋巴细胞、肝脏、脾脏、子宫、胸腺、胰腺、肌肉组织以及胎膜中均有表达。近年来的许多研究发现,visfatin与缺氧、易损斑块破裂、内皮功能紊乱、血管增生、炎症和糖脂代谢等密切相关,与动脉粥样硬化的发生发展过程密切相关。然而不同动脉粥样硬化性相关疾病患者血浆visfatin水平变化如何,本实验将做一探讨。目的通过检测动脉粥样硬化性相关疾病患者血浆visfatin水平,初步探讨血浆visfatin在动脉粥样硬化性相关疾病中的变化及其临床意义。方法将动脉粥样硬化性相关疾病(如冠心病、肥胖、代谢综合征、糖尿病、高血压等)患者和健康体检人群纳入研究对象,进行对照研究。通过酶联免疫吸附试验检测入选人群血浆visfatin水平,并同时抽血送检一般生化指标如空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C).低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、C反应蛋白(CRP)、同型半胱氨酸(HCY)等,收集临床资料,分析一般临床特征,包括年龄、性别、身高、体重、BMI、血压等。结果①冠心病组(CAD组)血浆visfatin水平较对照组明显升高[(3.17±0.36)ng/ml] vs. [(0.64±0.18)ng/ml] (p<0.05); CAD组各亚组中,多支病变组血浆visfatin水平[(4.27±0.47)ng/ml]和双支病变组血浆visfatin水平[(3.16±0.39)ng/ml]明显高于单支病变组[(1.95±0.36)ng/ml] (p<0.05),多支病变组血浆visfatin水平较双支病变组升高[(4.27±0.47)ng/ml] vs. [(3.16±0.39)ng/ml] (p<0.05);CAD组血浆visfatin水平随颈动脉内膜中层厚度(IMT)的增加而升高(p<0.05)；CAD组冠状动脉病变支数越多,颈动脉粥样斑块发生率越高(p<0.05)。在CAD组,血浆visfatin水平与BMI、TG、LDL-C、CRP、HCY、IMT和冠状动脉病变支数呈明显正相关(P<0.05)。②单纯性肥胖组血浆visfatin水平[(2.03±0.29)ng/ml]和代谢综合征组(MS组)血浆visfatin水平[(4.47±0.37)ng/ml]明显高于对照组[(0.59±0.21)ng/ml] (p<0.05), MS组血浆visfatin水平高于单纯性肥胖组[(4.47±0.37)ng/ml] vs. [(2.03±0.29)ng/ml] (p<0.05);MS组血浆visfatin水平随MS组分数的增加而升高(P<0.05)。在MS组,血浆visfatin水平与BMI、腰围、TG、LDL-C、FPG和MS组分数呈明显正相关(p<0.05),与HDL-C呈负相关(p<0.05)。③糖耐量异常组(IGT组)血浆visfatin水平[(2.23±0.39)ng/ml]和糖尿病组(DM组)血浆visfatin水平[(4.17±0.38)ng/ml]明显高于对照组[(0.67±0.20)ng/ml](p<0.05),DM组血浆visfatin水平高于IGT组[(4.17±0.38)ng/ml]vs. [(2.23±0.39)ng/ml] (p<0.05)。在DM组,血浆visfatin水平与BMI、腰围、TG±FPG和HbA1C呈明显正相关(p<0.05)。④高血压组血浆visfatin水平[(1.17±0.36)ng/ml]和对照组[(0.97±0.48)ng/ml]比较,差异无显著性意义(p>0.05)。结论通过以上研究发现冠心病、肥胖、代谢综合征、糖耐量异常、糖尿病等动脉粥样硬化性相关疾病均可导致血浆visfatin水平升高,为进一步阐明visfatin在动脉粥样硬化发生发展过程中的作用奠定了一定的临床基础。visfatin的发现为研究动脉粥样硬化性相关疾病的发病机制增加了新的思路,为动脉粥样硬化性相关疾病的防治提供了一个新的靶点。背景目前关于动脉粥样硬化的发病机制存在着诸多学说,如损伤-反应学说、炎症学说等,然而,我们注意到,所有学说最终都归结为泡沫细胞形成。泡沫细胞的形成是早期动脉粥样硬化的一个典型的病理特征,因此,研究泡沫细胞形成机制,对于有效预防动脉粥样硬化的发生与发展具有重要意义。巨噬细胞胆固醇代谢稳态的失衡贯穿于泡沫细胞形成的整个过程,参与巨噬细胞胆固醇代谢的两个关键酶,即酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1 (Acyl-CoA:cholesterol acyltransferases, ACAT1)催化细胞内游离胆固醇形成胆固醇酯,ATP结合盒转运子A1 (ATP-binding cassette transporters Al, ABCA1)促进细胞内游离胆固醇的流出。若ACAT1表达上调,胞内胆固醇酯合成增加,ABCA1表达下调,胞内游离胆固醇流出减少,两者协同作用导致巨噬细胞胆固醇代谢稳态的失衡,从而促进泡沫细胞的形成。那么visfatin对参与胆固醇代谢的关键酶ACAT1和ABCA1的表达是否具有调控作用呢?此方面的研究尚未见报道。目的研究单核／巨噬细胞分化成为泡沫细胞过程中visfatin对酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1(ACAT-1)和ATP结合盒转运子A1(ABCA1)表达的调控作用,明确visfatin致动脉粥样硬化的发病机制方法体外培养人源单核细胞系(THP-1),由佛波酯(PMA)作用将其诱导分化为巨噬细胞,巨噬细胞在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用下进一步转变为泡沫细胞。实验分为两部分：①不同浓度visfatin干预组(4组)：即泡沫细胞对照组(ox-LDL)、不同浓度visfatin干预组(10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7mol/L)。巨噬细胞分别加入上述不同浓度的visfatin,预孵2h后再加入ox-LDL 100mg/L,作用24h。采用油红O染色法观察泡沫细胞内脂滴形成情况,RT-PCR法检测ACAT1 mRNA、ABCA1 mRNA水平,Western-blot法检测ACAT1蛋白、ABCA1蛋白表达。②不同时间visfatin干预组(4组)：即泡沫细胞对照组(ox-LDL).不同时间干预组(12h、24h、48h)。巨噬细胞加入visfatin 10-5 mol/L,预孵2h后再加入ox-LDL 100mg/L,分别作用12h、24h、48h。采用油红O染色法观察泡沫细胞内脂滴形成情况,RT-PCR法检测ACAT1 mRNA、ABCA1 mRNA水平,Western-blot法检测ACAT1蛋白、ABCA1蛋白表达。结果①与泡沫细胞对照组相比,visfatin干预组油红O染色显示脂滴形成增加,ACAT1 mRNA水平及蛋白表达显著升高(p<0.05), ABCA1 mRNA水平及蛋白表达显著降低(p<0.05)；②不同浓度visfatin干预组之间比较,随着visfatin浓度越高,ACAT1 mRNA水平及蛋白表达越高(p<0.05), ABCA1 mRNA水平及蛋白表达越低(p<0.05)；提示visfatin上调ACAT1 mRNA及蛋白表达,下调ABCA1 mRNA及蛋白表达,且上述效应呈浓度依赖性；③不同时间visfatin干预组之间比较,随着visfatin作用时间越长,ACAT1 mRNA水平及蛋白表达越高(p<0.05), ABCA1 mRNA水平及蛋白表达降低(24h组vs.12h组,p<0.05),但在48h组ABCA1 mRNA水平及蛋白表达略高于24h组。提示visfatin上调ACAT1表达呈时间依赖性,下调ABCA1表达不完全呈时间依赖性。结论visfatin可明显增加THP-1源性泡沫细胞内脂滴的形成,增加THP-1源性泡沫细胞形成过程中ACAT1 mRNA水平和蛋白表达,减少ABCA1 mRNA水平和蛋白表达。提示visfatin可在转录及翻译水平通过上调ACAT1表达,增加胞内胆固醇合成,同时下调ABCA1表达,抑制胞内游离胆固醇流出,两者协同作用促进泡沫细胞形成。背景过氧化物酶体增生物激活受体y (peroxisome proliferator activated-receptor gamma, PPARy)属于转录因子核受体超家族的一员,其被证实能在巨噬细胞核内表达,并能通过调控脂蛋白酶和CD36等基因表达而调节脂质稳态。多项对特异性敲除巨噬细胞中PPARy小鼠的研究发现,动脉壁的脂质稳态严重受损,并促进动脉粥样硬化的发展,证实PPARy在抗动脉粥样硬化中发挥着重要作用[3,4]。同时PPARy信号通路参与调控巨噬细胞内胆固醇代谢,通过对其下游靶基因,包括ACAT1和ABCA1的调控,维持胆固醇代谢的稳态。我们前期研究证实visfatin能上调ACAT1的表达,下调ABCA1的表达,导致巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,那么PPARy信号通路是否参与了visfatin对ACAT1和ABCA1表达的调控作用呢?因此,在本实验中我们将观察PPARy信号通路在visfatin诱导泡沫细胞形成中的作用。目的探讨PPARy信号通路在visfatin诱导泡沫细胞形成中的作用。方法体外培养人源单核细胞系(THP-1),由佛波酯(PMA)作用将其诱导分化为巨噬细胞,巨噬细胞在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用下进一步转变为泡沫细胞。实验分为两部分：①不同浓度visfatin干预组(4组)：即泡沫细胞对照组(ox-LDL)、不同浓度visfatin干预组(10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7mol/L)。巨噬细胞分别加入上述不同浓度的visfatin,预孵2h后再加入ox-LDL 100mg/L,作用24h。采用油红O染色法观察泡沫细胞内脂滴形成情况,RT-PCR法检测PPARy mRNA水平,Western-blot法检测PPARγ蛋白表达。②不同时间visfatin干预组(4组)：即泡沫细胞对照组(ox-LDL)、不同时间visfatin干预组(12h、24h、48h)。巨噬细胞加入visfatin 10-5 mol/L,预孵2h后再加入ox-LDL 100mg/L,分别作用12h、24h、48h。采用油红O染色法观察细胞内脂形成情况,RT-PCR法检测PPARy mRNA水平,Western-blot法检测PPARy蛋白表达。结果①与泡沫细胞对照组比较,visfatin干预组油红O染色显示脂滴形成增加,PPARy mRNA水平和蛋白表达明显降低(p<0.05)；②不同浓度visfatin干预组之间比较,随着visfatin浓度越高,PPARy mRNA及蛋白水平越低(p<0.05),提示visfatin下调PPARy mRNA及蛋白表达,且该效应呈浓度依赖性；③不同时间visfatin干预组之间比较,随着visfatin作用时间延长,24h组PPARγmRNA水平和蛋白表达较12h组降低(p<0.05),但在48h组PPARγmRNA水平和蛋白表达高于12h和24h组,提示visfatin下调PPARγ表达不完全呈时间依赖性。结论visfatin可明显增加THP-1源性泡沫细胞内脂滴的形成,降低THP-1源性泡沫细胞形成过程中PPARγmRNA水平和蛋白表达。提示visfatin可在转录及翻译水平下调PPARγ表达,表明PPARγ信号通路参与了visfatin诱导泡沫细胞的形成。