背景随着研究的深入，发现脂肪组织不仅是静态的能量贮存器官，还是高度活跃的内分泌器官。脂肪细胞分泌的细胞因子主要包括：脂联素(adiponectin，APN)，抗素(resistin)，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα，TNFα)等。目前，在脂肪细胞因子的研究中，发现脂联素与动脉粥样硬化关系密切。脂联素能够减少脂质斑块的面积，抑制新生内膜的增厚及平滑肌细胞的增殖与迁移，抑制血管粘附分子的表达。通过这些作用，发挥抗动脉粥样硬化的保护性效应。脂联素是由脂肪组织分泌的胶原样蛋白质，从分子结构上看，脂联素与补体Clq相似。脂联素在脂肪细胞的分化过程中被诱导，其分泌受胰岛素调控。脂联素影响机体糖和脂质的代谢。在肥胖和2型糖尿病患者，血浆脂联素浓度降低，与胰岛素抵抗和2型糖尿病的危险性相关，而高血浆脂联素则能够降低2型糖尿病的危险。在脂联素基因敲除的小鼠表现出明显的胰岛素抵抗和糖耐量降低。在对动脉粥样硬化的研究中，新西兰大白兔是一种合适的动物模型，由于兔脂联素的序列尚未见报道，限制了利用该模型对脂联素的抗动脉粥样硬化作用进行深入研究。这些问题构成了本研究的设计思路和研究目的。研究目的1．克隆新西兰大白兔脂联素cDNA并完成测序。2．体外表达新西兰大白兔脂联素蛋白质，明确克隆的基因含完整的开放性阅读框架(ORF)。3．探讨不同年龄组的新西兰大白兔脂联素基因表达的变化，明确年龄与脂联素表达的关系。4．探讨高胆固醇饲料喂养后新西兰大白兔脂联素基因表达的变化，明确高脂血症与脂联素的关系。研究方法1．新西兰大白兔脂联素cDNA序列的测定(1)取普通饲料喂养的3月龄正常雄性新西兰大白兔颈背部皮下脂肪组织约100mg用于RNA的提取。(2)脂肪组织RNA提取：使用Trizol试剂从组织中提取总RNA。(3)兔脂联素基因片段的克隆：按照M-MLV逆转录酶试剂盒说明书配逆转录反应体系。根据人和小鼠脂联素高度保守序列设计PCR反应引物。上游引物：5′-ACACCTCCAGGGCTCAGGATGCT-3′，下游引物：5′-TCAGTTGGTATCATGGTAGAGAAG-3′。PCR反应后产物经琼脂糖凝胶电泳检测，割胶回收。并将其克隆入pGEM-T载体内，按试剂盒说明书操作。终产物命名为pGEM-T-APN。(4) pGEM-T-APN连接反应产物转化大肠杆菌JM109，筛选阳性重组体。(5)阳性重组体的菌落37℃摇床扩增，送上海英骏公司测序。2．新西兰大白兔脂联素蛋白质的体外表达新西兰大白兔脂联素蛋白质的体外表达与纯化采用pGAPZ_αPichia Expression Kit(Invitrogen)试剂盒。(1)以脂肪组织总cDNA为模板，用含EcoR I和Not I酶切位点的引物重新克隆脂联素DNA，并将产物插入pGEM-T载体，产物命名为pGEM／APN，经测序证实联结正确。(2)产物pGEM／APN与pGAPZ_αPichia酵母双酶切(EcoRI和Not I)，将脂联素DNA插入pGAPZ_αPichia酵母表达载体中，得到产物pGAPZ_α-APN。(3)将pGAPZ_α-APN转化大肠杆菌DH5α，在低盐LB培养基中扩增，抽提质粒，电转入GS115酵母菌株，培养，挑取阳性单克隆。(4)阳性单克隆在YPD培养基中培养，脂联素蛋白质分泌入上清液中。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，Western blot分析蛋白质分子量大小。(5)酵母培养液中脂联素浓度分析利用大鼠抗人脂联素ELISA试剂盒分析酵母上清液中脂联素浓度。3．年龄因素对新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的影响选取2周龄、1月龄、3月龄、6月龄、12月龄雄性新西兰大白兔各10只，3％戊巴比妥钠(30mg／kg)静脉麻醉后，各取颈背部皮下脂肪组织约100mg用于RNA的提取。荧光实时定量PCR检测脂肪组织mRNA的表达，ELISA试剂盒分析血清中脂联素浓度。4．高胆固醇饲料喂养后新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的变化为研究高胆固醇饲料喂养后新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的变化，3月龄雄性新西兰大白兔12只，体重1.5～2kg，1％高胆固醇饲料喂养，由山东省农科院购买。分别于高胆固醇饲料喂养前及喂养后第1、2、3、4月时间点取脂肪组织和静脉血标本。荧光实时定量PCR检测脂肪组织mRNA的表达，ELISA试剂盒分析血清中脂联素浓度。5．统计学分析：数据采用均数±标准误(mean±SEM)表示。组间比较采用方差分析，所有数据均用SPSS 13.0软件包处理，P＜0.05为统计学有显著性差异。结果1．新西兰大白兔脂联素cDNA序列测定经RT-PCR方法克隆出兔脂联素cDNA，测序证实含完整的开放性阅读框架(ORF)，即包含起始密码子(atg)和终止密码子(tga)。核苷酸序列分析显示兔脂联素cDNA序列与人、小鼠同源性分别为86.39％和81.45％，氨基酸序列的同源性分别为85.66％和85.25％。2．新西兰大白兔脂联素蛋白质的体外表达Western blot分析证实，GS115酵母上清液中含脂联素蛋白质，分子量约30 kDa。ELISA分析，上清液中蛋白质浓度为0.29±0.02μg／ml。3．年龄因素对新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的影响荧光实时定量PCR检测结果显示，不同年龄组的新西兰大白兔皮下脂肪组织脂联素mRNA表达有显著性差异(P＜0.01)，在1月龄组最高，然后随年龄增加而呈现出与年龄相关的下降趋势。血清脂联素浓度ELISA分析结果显示，不同年龄组的新西兰大白兔血清脂联素浓度有显著性差异(P＜0.01)，在1月龄组最高，然后随年龄增加而呈现出与年龄相关的下降趋势。4．高胆固醇饲料喂养后新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的变化高胆固醇饲料喂养后，脂肪组织脂联素基因mRNA转录与血清HDL-C浓度成正相关(Pearson Correlation=0.469，P=0.001)，在对照组无此相关性。在高脂组和对照组，不同的时间点脂肪组织脂联素基因mRNA转录均不同(Repeated Measurements Analysis of Variance，P＜0.01)：在高胆固醇饲料喂养前，2组之间脂联素基因mRNA转录无显著性差异(P＞0.05)；在高胆固醇饲料喂养后1、2、3、4月固定的时间点上，2组之间脂联素基因mRNA转录有显著性差异(P＜0.01)。高胆固醇饲料喂养对脂联素血清浓度有相似的影响：脂联素血清浓度与血清HDL-C浓度成正相关，在对照组无此相关性。在高脂组和对照组，不同的时间点脂联素血清浓度均不同；在高胆固醇饲料喂养前，2组之间脂联素血清浓度无显著性差异(P＞0.05)；在高胆固醇饲料喂养后1、2、3、4月固定的时间点，2组之间脂联素血清浓度有显著性差异(P＜0.01)。结论1．兔脂联素cDNA序列、氨基酸序列与人、小鼠均有高度的同源性，脂联素基因在兔、人、小鼠具有相似的功能。2．在不同的年龄组脂联素基因表达存在显著性差异，在1月龄组最高，随年龄增加而呈现出与年龄相关的下降趋势。3．脂质代谢异常对脂联素的基因表达有显著性影响，脂联素与血清高密度脂蛋白胆固醇成正相关。背景越来越多的研究表明，脂联素能够减少脂质斑块的面积，抑制新生内膜的增厚及平滑肌细胞的增殖与迁移，抑制血管粘附分子的表达。通过这些作用，发挥抗动脉粥样硬化的效应。通过抑制核转录因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)，脂联素抑制TNFα诱导的粘附分子的表达，抑制丝裂原活化蛋白(mitogen activated protein，MAP)通路进而抑制生长因子诱导的平滑肌细胞的增殖。在巨噬细胞，脂联素抑制清道夫受体的表达和泡沫细胞的形成。因此，脂联素积聚在内皮细胞损伤的部位，发挥抗动脉粥样硬化的保护性效应。目前国内、国际对脂联素与胰岛素抵抗、动脉粥样硬化的关系及作用机制方面做了大量的研究，但有许多问题尚未明了：1．在动物实验中观察到了脂联素减轻动脉内膜的增厚，降低动脉平滑肌细胞的增殖和迁移。脂联素是通过什么途径实现这种作用的?2．血管周存在脂肪组织，局部脂肪组织分泌的脂联素能否通过血管外膜影响动脉粥样硬化斑块的发生与发展?3．在动脉粥样硬化血管壁，通过转染携带脂联素基因的腺病毒，在体观察斑块的形态学改变如何，目前尚未见相关报道。以上这些问题，构成了本研究的设计思路和研究目的。研究目的1．对比脂联素通过内膜与外膜对动脉粥样硬化斑块的作用。2．观察脂联素对斑块易损性的影响。研究方法1．动脉粥样硬化新西兰大白兔动物模型的构建3月龄雄性新西兰大白兔70只，经右侧股动脉置入球囊导管，充盈球囊拉伤腹主动脉；1％高胆固醇饲料喂养，造成腹主动脉粥样硬化模型。2．腺病毒转染及血管内超声(intravascular ultrasonography，IVUS)检查高胆固醇喂养3月时，首先行IVUS检查。然后，将兔子随机分为4组，将携带脂联素基因的腺病毒载体(Ad-APN)或表达β半乳糖酐酶的腺病毒载体(Ad-βgal)转染到腹主动脉内膜和外膜。3．血清脂联素浓度分析利用大鼠抗人脂联素ELISA试剂盒分析普通饲料喂养大白兔、高胆固醇饲料喂养大白兔转染腺病毒前后血清脂联素浓度。4．组织学分析：腺病毒转染14天后，IVUS检查，处死，取局部转染部位腹主动脉标本。8μm厚冰冻切片做HE染色，天狼猩红染色，油红O染色。Image-Pro Plus 5.0图像分析软件计算粥样硬化斑块面积。并做黏附分子VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)，Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原、RAM11、α-actin的免疫组化分析，计算斑块易损指数。5．荧光实时定量PCR分析：荧光实时定量PCR方法检测腹主动脉黏附分子VCAM-1、ICAM-1，Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原mRNA表达的变化。6．统计学分析：组间比较采用方差分析(ANOVA)，所有数据均采用SPSS 13.0软件包处理，P＜0.05为统计学有显著性差异。数据采用均数±标准误(mean±SEM)表示。结果1．血管局部转染Ad-APN对动脉粥样硬化斑块的影响与转染前比较，血管局部转染Ad-APN后，血清脂联素浓度增加约9倍(P＜0.01)。与对照组转染Ad-βgal比较，血管局部转染Ad-APN后，血清脂联素浓度增加约10倍(P＜0.01)。血管局部转染Ad-APN后，与没有腹主动脉损伤正常胆固醇饲料喂养的新西兰大白兔比较，血清脂联素浓度增加约4倍(P＜0.01)。血管内膜局部转染Ad-APN后，动脉粥样硬化斑块面积与转染前相比明显缩小达35.17％(P＜0.01)，管腔面积狭窄率减小32.71％(P＜0.01)，与对照组(转染Ad-βgal)相比斑块面积缩小35.82％(P＜0.01)，管腔面积狭窄率减小24.09％(P＜0.01)。血管外膜转染Ad-APN与转染前相比，斑块面积明显缩小达28.92％(P＜0.01)，管腔面积狭窄率减小23.57％(P＜0.01)，与外膜转染Ad-βgal相比斑块面积缩小25.64％(P＜0.01)，管腔面积狭窄率减小19.43％(P＜0.05)；内膜或外膜转染Ad-βgal前后斑块面积均无统计学意义(P＞0.05)。油红O染色结果：内膜或外膜转染Ad-APN与对照组相比斑块面积缩小(P＜0.01)，斑块最大厚度减小(内膜转染与对照组相比：P＜0.01；外膜转染与对照组相比：P＜0.05)。内膜和外膜转染Ad-APN斑块面积、最大厚度两组间无统计学差异(P＞0.05)。2．脂联素对血管壁黏附分子表达的影响内膜转染Ad-APN与转染Ad-βgal比较：VCAM-1mRNA的表达降低18.5％(P＜0.05)，ICAM-1 mRNA的表达显著降低40.7％(P＜0.01)。外膜转染Ad-APN与转染Ad-βgal比较：VCAM-1 mRNA的表达降低26.9％(P＜0.01)，ICAM-1mRNA的表达降低30.7％(P＜0.01)。3．脂联素对血管壁胶原分子表达的影响内膜转染Ad-APN与转染Ad-βgal比较：血管壁Ⅰ型胶原mRNA的表达为1.82±0.26 versus 1.55±0.17％，P＞0.05，Ⅲ型胶原mRNA的表达为26.96±5.12 versus25.15±3.67％，P＞0.05。外膜转染Ad-APN与转染Ad-βgal比较：血管壁Ⅰ型胶原mRNA的表达为2.51±1.07 versus 1.86±0.28％，P＞0.05，Ⅲ型胶原mRNA的表达为19.98±3.20 versus23.07±4.07％，P＞0.05。4．脂联素对动脉粥样硬化斑块易损性的影响腹主动脉内膜局部转染Ad-APN组血管壁血管壁天狼猩红染色阳性百分比无显著性差异(P＞0.05)，α-actin表达增加28.88％(P＜0.01)，油红O染色阳性百分比降低24.48％(P＜0.01)，RAM11染色阳性百分比降低28.89％(P＜0.01)，易损指数显著降低33.78％(P＜0.01)。腹主动脉内膜局部转染Ad-APN组血管壁血管壁天狼猩红染色阳性百分比无显著性差异(P＞0.05)，α-actin表达增加23.88％(P＜0.01)，油红O染色阳性百分比降低25.54％(P＜0.01)，RAM11染色阳性百分比降低32.11％(P＜0.01)，易损指数显著降低27.03％(P＜0.01)。结论1．动脉粥样硬化病变血管内膜或外膜局部转染Ad-APN后，斑块的面积缩小，同时，血清脂联素浓度明显升高，脂联素可通过抑制血管壁黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表达发挥抗动脉粥样硬化的作用；脂联素通过血管外膜或内膜对动脉粥样硬化的作用是一致的。2．血管内膜或外膜局部转染Ad-APN后，脂联素对血管壁Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达没有影响。3．局部转染脂联素基因后，动脉粥样硬化斑块内胶原的含量虽然无明显变化，而斑块内平滑肌细胞量的增加，脂质含量和巨噬细胞的数量降低，可使斑块的易损性降低。