原发性肝癌是临床上多见，治疗难度高的恶性肿瘤之一。谈癌色变的当今社会，能有效治疗肝癌的手段有限，具有手术指征的患者以根治性手术切除肿瘤为主要治疗手段，根据不同时期、不同病情变化还可以结合介入治疗、射频消融治疗、免疫治疗、化疗、放疗以及中医药治疗。然而严重影响肝癌患者生活质量、生存期的重要因素是肝癌术后复发率高，因此如何促进肝癌术后休眠，预防复发成为医学界近年来研究的热点。随着对中医药治疗肿瘤的临床观察以及实验研究的逐步深入，发现中医药在抑制肿瘤细胞的活性、调节免疫、提高生活质量、延长生存期等方面发挥着重要作用。健脾化瘀方是传承于上海名老中医钱伯文教授，经名中医王昌俊教授临床观察及实验研究后优化而来，具有扶正祛邪之功，适用于肝癌术后，祛癌毒同时固护正气以预防肿瘤术后复发。本课题组前期实验研究发现，健脾化瘀方能通过调节免疫微环境以达到抗肿瘤，促休眠的治疗效果，然而具体机制尚未明确，因此进一步深入研究健脾化瘀方调节免疫抗肿瘤机制具有重要意义。外泌体是广泛存在于各种细胞、组织、体液中的小囊泡，其内含有大量miRNA如miR-21等信息，被认为是细胞间信息传递的重要介质，研究发现外泌体在肿瘤发生发展全过程发挥重要作用。miR-21被发现是可能发挥致癌作用的miRNA，而miR-21的表达与树突状细胞的分化呈负相关，miR-21下调甚至缺失可促使树突状细胞分化同时刺激其分泌IL-12增加，因而激活CD4+T细胞分化发育能力增强。因此本人推测健脾化瘀方可能通过影响外泌体中miR-21的表达，改变免疫微环境，从而促使肝癌休眠，预防肿瘤复发。
　　目的：
　　通过体内实验研究明确外泌体中miR-21的表达改变免疫微环境从而影响肝癌术后休眠复发，探讨健脾化瘀方通过对外泌体中miR-21表达的干预，调节免疫微环境，防治肝癌术后复发的作用。
　　方法：
　　实验分两部分进行，第一部分：培养人肝癌细胞株SMCC-7721，接种于裸鼠肝脏上建立原位肝癌裸鼠模型，在原位肝癌裸鼠的基础上行肝癌根治性切除术建立肝癌术后休眠裸鼠模型，对肝癌术后休眠裸鼠予外伤刺激诱导肝癌复发建立肝癌复发裸鼠模型，共建立三种裸鼠模型。实验分为正常对照组、原位肝癌组、肝癌术后休眠组以及肝癌复发组，期间密切观察裸鼠的一般情况，肿瘤状态并作记录，然后结合解剖观察以及病理学检测评估肿瘤成瘤、休眠、复发情况。采集各组裸鼠血清、肺脏、肝脏，从血清中提取外泌体，通过电镜及NTA技术对外泌体进行鉴定，并利用qRT-PCR检测外泌体中miR-21的表达水平;通过流式细胞术以及ELISA分别检测血清、肺脏、肝脏中CD4+T细胞水平以及IL-12的水平。第二部分：同样培养人肝癌细胞SMCC-7721，建立肝癌术后休眠模型，分别给予健脾化瘀方灌胃和五氟尿嘧啶腹腔注射干预，实验分为肝癌术后休眠组、健脾化瘀方组和五氟尿嘧啶组，予外伤刺激和饮食失调诱导肿瘤复发，密切观察裸鼠的一般情况，肿瘤状态并作记录，然后结合解剖观察以及病理学检测评估肿瘤休眠、复发情况。最后采集各组裸鼠血清、肺脏、肝脏，从血清中提取外泌体，通过电镜及NTA技术对外泌体进行鉴定，并利用qRT-PCR检测外泌体中miR-21的表达水平;通过流式细胞术以及ELISA分别检测血清、肺脏、肝脏中CD4+T细胞水平以及IL-12的水平。
　　结果：
　　一、外泌体中miR-21的表达影响肝癌免疫微环境
　　（一）造模后28天内各组裸鼠精神状态、进食以及活动情况均正常，各组裸鼠体表均未出现可疑肿物，肝区未见肿瘤外突。后期原位肝癌组1只裸鼠腹部轻度胀满，考虑可疑腹水生成。
　　（二）病理学检测结果显示在原位肝癌组以及肝癌复发组中切除的肿块确定是癌灶，可见肿瘤细胞浸润;肝癌术后休眠组中切取的癌旁组织未见肿瘤细胞，可认为肿瘤基本被切除;而且在其余肝、肺、肠、脾脏器上并未找到肿瘤细胞，表示各组未发生肝内及远处转移。
　　（三）外泌体鉴定结果显示大部分外泌体呈现出类圆形，少部分呈杯子形、单层膜的小囊泡，粒径大小主要集中在133nm左右，其次在193nm、258nm左右均出现相对峰值，不排除外泌体出现相互间聚集所致。
　　（四）在各肝癌状态下外泌体中miR-21对免疫微环境的负性调节：qRT-PCR检测四组外泌体中miR-21的表达，原位肝癌组和肝癌复发组外泌体中miR-21的表达均高于肝癌术后休眠组（P＜0.05）。流式细胞术检测四组血液、肝脏、肺脏中CD4+T细胞水平，原位肝癌组明显低于正常对照组（P＜0.05）;仅肝脏中，原位肝癌组明显低于肝癌术后休眠组（P＜0.05）;仅肺脏中，肝癌复发组明显低于肝癌术后休眠组（P＜0.05)。ELISA检测四组血液、肝脏、肺脏中IL-12的水平，原位肝癌组和肝癌复发组IL-12水平均显著低于肝癌术后休眠组和正常对照组（P＜0.05)。
　　二、健脾化瘀方对肝癌术后休眠复发的防治作用
　　（一）手术切除肿瘤至给药结束期间，健脾化瘀方组裸鼠精神状态、进食以及活动情况均正常。给药21天后至给药结束，肝癌术后休眠组中5只裸鼠出现轻度腹部胀满，1只裸鼠出现消瘦，2只裸鼠同时出现轻度腹部胀满和消瘦;五氟尿嘧啶组中5只裸鼠出现消瘦，1只裸鼠同时出现轻度腹部胀满和消瘦;健脾化瘀方组裸鼠未出现腹部胀满、消瘦等不良情况。出现腹部胀满的裸鼠考虑可疑腹水生成。各组裸鼠体表均未出现可疑肿物，肝区未见肿瘤外突。对三组裸鼠出现不良症状个数进行比较，发现健脾化瘀方组出现不良症状明显少于肝癌术后休眠组和五氟尿嘧啶组（P＜0.05）。
　　（二）病理学检查结果显示肝癌术后休眠组、健脾化瘀方组以及五氟尿嘧啶组分别有13只、9只、8只裸鼠出现肝癌原位复发，病理可见肿瘤细胞浸润;各组肉眼未见可疑复发灶的裸鼠切取的癌旁组织未见肿瘤细胞，可认为肿瘤未原位复发;而且在其余肝、肺、肠、脾脏器上并未找到肿瘤细胞，表示各组未发生肝内及远处转移。对三组肝癌复发率进行比较，三组间肝癌复发率没有统计学差异（P＞0.05）。
　　（三）外泌体鉴定结果显示大部分外泌体呈现出类圆形，少部分呈杯子形、单层膜的小囊泡，粒径大小主要集中在161nm左右，其次在221nm左右亦出现相对峰值，考虑外泌体出现相互间聚集所致。
　　（四）健脾化瘀方对外泌体中miR-21表达及免疫微环境的作用：qRT-PCR检测三组外泌体中miR-21的表达，健脾化瘀方组外泌体中miR-21的表达低于肝癌术后休眠组和五氟尿嘧啶组（P＜0.05）。流式细胞术检测三组血液、肝脏、肺脏中CD4+T细胞水平，在血液层面，健脾化瘀方组和五氟尿嘧啶组CD4+T细胞水平显著高于肝癌术后休眠组（P＜0.05）;在肝脏层面，健脾化瘀方组的水平高于肝癌术后休眠组和五氟尿嘧啶组（P＜0.05）;在肺脏层面，五氟尿嘧啶组的水平高于健脾化瘀方组和肝癌术后休眠组（P＜0.05）。ELISA检测三组血液、肝脏、肺脏中IL-12的水平，五氟尿嘧啶组IL-12水平高于肝癌术后休眠组和健脾化瘀方组（P＜0.05）。
　　结论：
　　各肝癌状态下，外泌体中miR-21对肿瘤免疫微环境具有负性调节作用，健脾化瘀方能通过对外泌体中miR-21表达的抑制，改善免疫微环境，增强免疫，一定程度上可预防肝癌术后复发，提高生存质量。