论文部分内容阅读
研究背景:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是导致肝硬化、肝癌的高危因素,但其发病机制未明,故治疗手段有限。近年来发现肝内炎症反应和细胞代谢在NAFLD中发挥重要作用,叉头转录因子O1(Forkhead Box O1,FoxO1)被认为在调节葡萄糖代谢和脂质代谢中起着重要作用。NAFLD进展过程中伴随着内质网应激和坏死性凋亡,然而FoxO1在非酒精性脂肪性肝病中调节内质网应激和坏死性凋亡的关系尚未完全阐明。本实验通过研究FoxO1在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的作用,并采用体内、外实验、FoxO1抑制剂AS1842856初步探讨FoxO1调节内质网应激及坏死性凋亡缓解NAFLD发展的作用,旨在为NAFLD的治疗寻找新靶点提供新思路。目的:探讨FoxO1对NAFLD内质网应激和坏死性凋亡的影响,靶向抑制FoxO1后缓解NAFLD发生发展的作用及机制研究方法:一、FoxO1在NAFLD发展中的作用研究1、体内实验:构建NAFLD小鼠模型,通过检测血清甘油三酯、血清胆固醇、油红染色和HE染色鉴定NAFLD模型是否构建成功。采用Western Blot检测正常和NAFLD小鼠肝脏中FoxO1和p-FoxO1的表达水平。2、体外实验:构建NAFLD细胞模型:选择人肝癌细胞系HepG2细胞作为研究对象,使用不同浓度的棕榈酸处理培养基,选取最佳浓度培养细胞24h。采用Western Blot检测细胞内FoxO1和p-FoxO1的表达水平。二、内质网应激和坏死性凋亡在NAFLD发展中的作用研究1、体内实验:构建NAFLD小鼠模型,采用Western Blot检测肝脏内内质网应激相关蛋白(PERK、BIP、CHOP)、坏死性凋亡相关蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)的表达水平。2、体外实验:构建NAFLD细胞模型,采用Western Blot检测细胞内内质网应激相关蛋白(PERK、BIP、CHOP)、坏死性凋亡相关蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)的表达水平。三、FoxO1调节内质网应激和坏死性凋亡影响NAFLD发展的机制研究1、体内实验:将C57BL/6小鼠分为三组:对照组、高脂饮食组、高脂饮食+FoxO1抑制剂组,16周后通过Western Blot检测小鼠肝脏内质网应激相关蛋白(PERK、BIP、CHOP)、坏死性凋亡相关蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL)的表达水平;电镜观察小鼠肝脏内质网形态。2、体外实验:构建NAFLD细胞模型:1.0umol/L浓度的FoxO1抑制剂AS1842856预处理HepG2细胞2h,用0.75mmol/L浓度的棕榈酸培养HepG2细胞24h;Western Blot检测HepG2细胞总FoxO1和p-FoxO1蛋白,内质网应激相关蛋白(PERK、BIP、CHOP)、坏死性凋亡相关蛋白(RIP1、RIP3、p-MLKL);qRT-PCR检测HepG2细胞内FoxO1下游基因CDKN1B mRNA、PMAIP1 mRNA、BCL2L11 mRNA和TNFSF10 mRNA表达量.结果:1、高脂饮食可使小鼠体重增加,ALT、AST、TC、TG升高,小鼠肝脏脂肪变性,同时肝脏FoxO1激活,磷酸化FoxO1减少。随着棕榈酸浓度升高,HepG2细胞FoxO1表达升高,p-FoxO1表达减少,证明FoxO1参与NAFLD的发生发展。2、高脂饮食可以激活小鼠肝脏内质网应激和坏死性凋亡。随着棕榈酸浓度升高,HepG2细胞内质网应激和坏死性凋亡相关蛋白也表达升高,证明内质网应激和坏死性凋亡参与NAFLD的发展过程。3、抑制FoxO1可以减少小鼠肝细胞内质网应激及坏死性凋亡相关蛋白的表达,内质网损伤减轻。FoxO1抑制剂的使用可以减少HepG2细胞内质网应激和坏死性凋亡相关蛋白表达,FoxO1下游TRAIL mRNA表达减少,证明FoxO1可以调节内质网应激和坏死性凋亡影响NAFLD的发展,这一过程可能通过FoxO1下游靶基因TRAIL介导。结论:在NAFLD小鼠模型中,FoxO1通过加重内质网应激和坏死性凋亡促进NAFLD的进程,靶向抑制FoxO1可通过TRAIL减轻内质网应激、坏死性凋亡逆转NAFLD。