论文部分内容阅读
背景：维护小肠上皮的完整依赖于上皮细胞的增殖，生长和凋亡之间的平衡。凋亡抑制蛋白XIAP(X-link inhibitor of apoptosis protein)在小肠细胞上皮的凋亡中有重要作用，是抑制细胞凋亡的关键蛋白。但RNA结合蛋白HuR能与含AREs（AU rich element）的目的基因的mRNA结合，能稳定目的基因的mRNA，并促进目的基因的翻译，对目的基因进行转录后调节。在对XIAP mRNA的研究中发现，XIAP mRNA具有AREs，可能是HuR的识别片段，HuR可能能通过与XIAP mRNA的AREs结合而对XIAP的表达进行转录后调节。多胺是一类广泛存在于生物体各种组织细胞中的脂肪胺类，对小肠上皮细胞生长、增殖和迁移，修复黏膜、维持黏膜完整有重要作用。多胺耗竭能提高小肠上皮细胞抗凋亡能力，小肠上皮细胞的XIAP表达增高，促进HuR从细胞核内向细胞浆内迁移，细胞浆内的HuR表达增高。但其确却的作用机制仍不明确。甘草的有效单体成分甘草酸具有保护上皮，维护上皮完整的作用，在此前的研究中发现甘草酸能促进一些HuR的目的基因如Bcl-2，p53的表达，但其具体的作用机制不明确。 假说：RNA结合蛋白HuR能与XIAP mRNA结合并调节其表达，在多胺耗竭后，HuR从细胞核内向细胞浆内迁移，细胞浆内增高的HuR可与XIAP mRNA结合，稳定XIAP mRNA,使其衰减减慢，从而导致XIAP表达增高，多胺耗竭是通过增高的HuR对XIAP进行转录后调节，促进XIAP的表达，从而提高小肠上皮细胞的抗凋亡能力,甘草酸亦可能通过此途径对RNA结合蛋白及其目的基因进行转录后调节。 本课题的研究，集中在HuR对XIAP表达的转录后调节作用，研究多胺耗竭是否能通过增加HuR在细胞浆中的含量，增加HuR与XIAP mRNA的结合，对XIAP进行转录后调节，从而抗细胞凋亡，明确HuR对XIAP转录后调节作用，多胺耗竭对小肠上皮细胞抗凋亡作用机制。在此同时，将该思路和方法引入中药作用的分子机制研究。将对有保护上皮作用的甘草有效成分甘草酸对RNA结合蛋白的表达及HuR的目的基因表达影响进行研究，以探讨甘草酸是否能通过RNA结合蛋白调节目的基因的表达。 通过此研究，明确RNA结合蛋白HuR对XIAP的转录后的调节作用和机制，阐明多胺耗竭通过HuR对XIAP mRNA的转录后调节，并明确其抗细胞凋亡的作用和机制。并将该思路和方法引进中药有效成分的作用机制研究中，初步探讨甘草酸在此途径中的作用。同时为建立中药成分的分子和细胞作用机制研究技术平台提供基础。 方法： 1. HuR对XIAP转录后调节作用 1.1 HuR与XIAP mRNA的相互作用：分别用pull down和mRNP IP分析HuR与XIAP的mRNA的体外和体内结合 1.2 HuR过表达对XIAP转录后调节 1.2.1 HuR过表达细胞模型：用能表达HuR的腺病毒载体感染大鼠小肠上皮细胞IEC-6过表达HuR，后用western blot检测HuR的表达量。 1.2.2 HuR过表达对XIAP mRNA稳定性的影响：HuR过表达后用actinomycin D终止细胞RNA的合成，在RNA合成终止后的相应时间点提取RNA，用RT-PCR和RT-Q-PCR检测XIAP mRNA的含量。 1.2.3 HuR过表达对XIAP mRNA翻译的影响：首先针对Pubmed上的基因库中查出大鼠XIAP的完整基因序列，用带EcoR1和Kpn1酶切位点的引物用 PCR扩增完整的XIAP CR（去除起始密码子atg）和XIAP3’UTR，将PCR扩增产物，pEGFP C1， pEGFP N1进行EcoR1和Kpn1双酶切，后用T4 DNA接酶连接酶切片段和质粒，将 XIAP CR插入 pEGFP N1，置于报告基因 EGFP之前（pEGFP N1-XIAP CR）；将XIAP3’UTR插入pEGFP C1，置于报告基因EGFP之后（pEGFP N1-XIAP3’UTR）。后转化感受态细胞 DH5α，通过卡那霉素抗性筛选挑取阳性克隆，抽提质粒，后进行测序法鉴定。对细胞进行HuR过表达处理，再转染相应的质粒，后观察HuR过表达对质粒报告基因表达的影响，由此观察HuR通过XIAPmRNA对XIAP翻译表达的作用。 1.2.4 HuR过表达对XIAP表达的影响：HuR过表达后，用western blot检测XIAP表达量。 1.3 HuR沉默对XIAP转录后调节 1.3.1 HuR表达沉默的细胞模型：用siHuR转染IEC-6，建立HuR沉默的细胞模型； 1.3.2 HuR表达沉默对XIAP转录后调节：HuR沉默后，如前检测XIAPmRNA的稳定性和XIAP的表达；转染pEGFP N1-XIAP CR或pEGFP N1-XIAP3’UTR，观察HuR沉默通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的作用。 2．多胺对XIAP转录后调节 2.1多胺耗竭细胞模型建立：用多胺合成关键酶ODC（鸟氨酸脱羧酶）的抑制剂DFMO建立多胺耗竭模型。 2.2多胺耗竭对XIAP转录后调节：DFMO处理后，如前检测XIAP mRNA与HuR的结合， XIAP mRNA的稳定性和XIAP的表达，转染pEGFP N1-XIAP CR或pEGFP N1-XIAP3’UTR，观察DFMO通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的作用。 2.3 HuR沉默对DFMO对XIAP转录后调节作用的影响： DFMO作用后，用RNA干扰将HuR沉默，后观察XIAP mRNA稳定性，XIAP的表达，以及对XIAP翻译作用的影响。 3．DFMO通过HuR和XIAP对细胞抗凋亡能力的影响：在DFMO作用后，沉默XIAP或HuR的表达，用TNF-α/CHX诱导凋亡，后观察细胞凋亡数量，ANNEXIN V染色，观察caspase3含量。 4．甘草酸对RNA结合蛋白对目的基因转录后调节的影响 4.1甘草酸对RNA结合蛋白的影响：在甘草酸作用48h后，检测细胞核内及细胞浆RNA结合蛋白HuR及TIAR的表达。 4.2甘草酸对HuR目的基因的表达影响：甘草酸作用后检测ATF-2和XIAP的表达影响以及HuR与ATF-2内源性结合。 结果： 1. HuR与XIAP mRNA的相互作用：发现HuR不但能与XIAP mRNA3’UTR结合，还能与XIAP CR结合。 2.HuR对XIAP转录后调节作用 2.1 HuR过表达对XIAP转录后翻译的调节： 2.1.1 HuR过表达对XIAP mRNA稳定性及蛋白质表达的影响：发现HuR过表达后的半衰期延长，稳定性增加。HuR过表达能促进XIAP蛋白质的表达，在20-200pfu/cell浓度范围内，其作用呈比例增长。同时用荧光染色发现，XIAP的分布主要在细胞浆内，HuR过表达后，其荧光量明显增加。 2.1.2 HuR过表达通过XIAP mRNA对XIAP的翻译表达的影响：在HuR过表达后，转染XIAP CR或XIAP3’UTR的质粒，与对照组比较，HuR过表达后能增加其报告基因EGFP的表达，说明HuR能通过XIAP CR和XIAP3’UTR增加XIAP的翻译。 2.2 HuR沉默对XIAP转录后翻译的调节 2.2.1 HuR沉默对XIAP mRNA稳定性和XIAP蛋白表达的影响：HuR沉默后能加速XIAP mRNA的降解，缩短其半衰期，降低XIAP蛋白表达。 2.2.2 HuR沉默通过XIAP mRNA对XIAP的翻译表达的影响：在HuR沉默后，转染XIAP CR或XIAP3’UTR的质粒，与对照组比较，HuR沉默后能降低其报告基因EGFP C1的表达，说明HuR沉默能通过XIAP CR和XIAP3’UTR降低XIAP的翻译表达。 3.多胺通过HuR对XIAP转录后翻译调节作用 3.1多胺耗竭对HuR与XIAPmRNA结合的影响：在DFMO处理后，两者的结合增强，说明多胺耗竭能使XIAP mRNA与HuR的结合增强。 3.2多胺耗竭对XIAP mRNA转录后调节 3.2.1多胺耗竭对对XIAP mRNA稳定性和翻译的影响：在DFMO处理后，与对照组比较，XIAP mRNA的稳定性明显增高，XIAP的表达增高。说明DFMO能增高HuR与XIAPmRNA的结合，从而增高XIAP mRNA的稳定性，促进XIAP蛋白质的表达。 3.2.2多胺耗竭通过XIAP mRNA对XIAP翻译表达的影响：在DFMO处理后，对于不含XIAP CR的质粒，其报告基因EGFP的表达无明显的作用，对于含XIAP CR的质粒， DFMO后能增高其报告基因EGFP N1的表达；对于XIAP3’UTR，DFMO处理后能增高其报告基因EGFP C1的表达，说明DFMO能通过XIAP CR和XIAP3’UTR增加XIAP的翻译表达。 3.2.3 HuR沉默逆转DFMO对XIAP转录后翻译的上调作用：在HuR沉默后，DFMO对XIAP mRNA稳定性的增高，XIAP的表达增高以及XIAP翻译的增高作用完全被逆转，而与对照组相接近。 4．DFMO通过HuR增高XIAP表达，从而提高细胞抗凋亡能力： 4.1在DFMO作用后，并用TNF-α/CHX诱导凋亡，发现在DFMO作用后，细胞抗凋亡能力大为提高， TNF-α/CHX的诱导后，与对照组比较，细胞凋亡明显减少， procaspase3的剪切明显减少。 4.2在DFMO作用后，沉默XIAP或HuR的表达，用TNF-α/CHX诱导凋亡，发现在沉默 HuR后，细胞抗凋亡能力明显下降，凋亡细胞数量明显增加，procaspase3的剪切明显增加，caspase3含量明显增高。表明HuR沉默能阻断DFMO的抗凋亡作用。在沉默XIAP后出现同样的情况，XIAP沉默同样能阻断DFMO的抗凋亡作用。该结果表明，DFMO的抗凋亡作用是通过HuR增高的XIAP产生作用的。 5．甘草酸对RNA结合蛋白对目的基因转录后调节的影响 5.1甘草酸对RNA结合蛋白的影响：在甘草酸作用48h后，能促进HuR从细胞核内向细胞浆转移，增加在细胞浆内的含量，对TIAR没有明显的影响。 5.2甘草酸对HuR目的基因的表达影响：甘草酸能增加ATF-2的表达，但对XIAP的表达无明显影响。 5.3甘草酸对HuR与目的基因的mRNA内源性结合的影响：在甘草酸作用48h后，ATF-2与HuR的内源性结合明显增加。 结论： RNA结合蛋白HuR能与XIAP mRNA结合并调节其表达，稳定XIAP mRNA，促进XIAP的翻译表达，对XIAP进行转录后表达调节。在多胺耗竭后， HuR从细胞核内向细胞浆内转移，细胞浆内增高的HuR可与XIAP mRNA结合，稳定XIAP mRNA,使其衰减减慢，从而导致XIAP的翻译表达增高，DFMO通过增高细胞激浆内的HuR含量，促进XIAP的表达，从而提高细胞的抗调亡能力。甘草酸能促进HuR从细胞核内向细胞浆内转移，同时增高ATF-2的表达。