内皮抑素（Endostatin,ES）是一种内源性的新生血管生成抑制因子,能够有效地抑制新生血管的形成,从而切断肿瘤的营养供给途径和废物代谢途径,起到抑制肿瘤的生长和转移的作用。基于这样一种原理,ES作为一种抗肿瘤药物,与化疗药物相比具有极低的毒副作用、广谱抑瘤作用,并且在长期反复治疗中不会引起耐药性。目前,ES在国内已经作为一种用于治疗非小细胞性肺癌的药物应用于临床。然而,目前仍然有一些较大的障碍大大地限制了其临床应用。ES应用于人体的有效剂量是300 mg/m²·d,如此大的剂量不但易对人体产生意想不到的副作用,而且也导致患者费用用药高,这是限制ES临床应用的最大障碍。另外,ES稳定性差、体内半衰期短也使其保存条件比较苛刻、用药次数较为频繁。如果能够通过一定的手段提高其稳定性、延长其体内半衰期、提高其体内活性从而减少给药剂量或延长给药周期,将会大大提高ES的治疗效果,促进其在临床上的应用。本课题运用了化学修饰的方法采用三种不同的化学修饰剂[聚乙二醇（PEG）、低分子肝素（LMWH）和多硫酸化肝素（PSH）]对ES进行结构修饰,并研究探讨了修饰后ES的二级结构改变、稳定性变化、生物活性变化、结构变化及其与活性的关系以及小鼠体内的药代动力学和组织分布,以期获得一种较为理想的ES修饰物,并探讨不同结构的修饰剂对ES性质的影响。本课题的研究内容及取得的主要成果有以下几个方面。1内皮抑素的分离纯化及三种修饰剂对其化学修饰及修饰后热稳定性研究含ES基因的毕赤酵母菌表达上清液经纤维素CMⅡ离子交换层析柱和Superdex 75凝胶过滤层析柱分离纯化得到电泳单点纯的ES,并通过MTT比色法验证了其抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的活性。采用氰尿酰氯法活化PEG,活化后的PEG在pH 9.0、10 mmol/L的四硼酸钠缓冲液中对ES进行化学修饰;采用高碘酸钠氧化法活化LMWH,活化后的LMWH于pH 9.5、0.3 mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中对ES进行化学修饰;采用高碘酸钠氧化法活化PSH,活化后的PSH于pH 9.5、0.3 mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中对ES进行化学修饰。通过SDS-PAGE监测修饰反应过程,比较不同时间点修饰液中ES的自由氨基修饰率、活性保留百分率以及电泳监测结果,确定三种修饰剂对ES的化学修饰结果均为一分子ES可与三分子的修饰剂相结合,PEG、LMWH和PSH修饰ES较理想的修饰反应时间分别为为24 h、48 h和48 h。将修饰反应液经预处理后,使用Superdex 75凝胶过滤层析柱进行分离纯化,获得了ES的修饰物PEG-ES,LMWH-ES和PSH-ES。本研究考察了ES及其修饰物在25℃和37℃水浴中的热稳定性,发现修饰后的ES较未修饰的热稳定性有明显提高。25℃时,其稳定性为PEG-ES,PSH-ES＞LMWH-ES＞ES;37℃时,其稳定性PEG-ES＞PSH-ES,LMWH-ES＞ES。2内皮抑素及其修饰物的二级结构分析采用圆二色谱法（CD）对ES及其修饰物的二级结构进行研究,并比较其差别。结果显示PEG-ES中β-转角成分变化较大,由原来的16.20%变化为23.21%,其他成分变化较小,与前期利用傅立叶变换红外光谱分析所得结果一致;LMWH-ES中ES二级结构各成分较未修饰的ES变化均较小,也与前期利用傅立叶变换红外光谱分析所得结果一致;PSH-ES中β-反平行变化较大,由1.17%变化为3.52%,但由于β-反平行在ES二级结构构象中所占总体比例非常小,PSH-ES的二级结构较未修饰的ES变化也不大。总体而言,除PEG-ES的β-转角成分外,三种修饰产物的二级结构与ES比较无较大变化。3内皮抑素及其修饰物对内皮细胞亲和性研究3.1流式细胞术研究内皮抑素及其修饰物对内皮细胞亲和性借助流式细胞检测考察了ES及其三种结合物对内皮细胞的结合能力。FITC标记的ES、PEG-ES、LMWH-ES以及PSH-ES与内皮细胞共同孵育,研究表明,PSH-ES对细胞的结合能力最强,其次是LMWH-ES和PEG-ES,阳性率分别为57.15%、54.08%和48.01%,而ES孵育组阳性率只有18.47%。3.2激光共聚焦显微镜技术研究ES及其修饰物内皮细胞内分布FITC标记的ES及ES衍生物与内皮细胞共孵育1h后,ES组的荧光信号较弱,而PEG-ES组、LMWH-ES组和PSH-ES组的荧光信号与ES相比有不同程度的增强,且LMWH-ES和PSH-ES组荧光略强于PEG-ES组。FITC标记的ES及ES衍生物与内皮细胞共孵育2h后,荧光强度均比1h时的相同药物组有不同程度的增强,且三个修饰物组均表现出比ES组更强的荧光强度。4内皮抑素及其修饰物抑制血管生成及抗肿瘤作用研究将纯化后的ES及其修饰物作用于鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管,以蒸馏水作为空白对照,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为阴性对照,观察了ES及其修饰物对bFGF诱导的CAM血管生成的抑制作用。结果表明,纯化后的ES能够明显抑制bFGF诱导的CAM血管的生成,与bFGF组比较,CAM血管数由（25.2±3.55）减少为（11.3±1.24）（ES浓度为0.5μg/embryo）（P＜0.05）。随着ES浓度的增大,抑制作用增强,血管分支数目减少,血管密度降低。PEG,LMWH和PSH修饰的ES也能够明显地抑制bFGF诱导的CAM血管的生成,血管数分别减少为（11.8±1.38）、（10.8±2.14）和（8.6±0.53）,除PEG-ES外其抑制活性均高于较未修饰的ES。利用激光烧伤法造成脉络膜新生血管（CNV）模型,然后将纯化后的ES及其修饰物玻璃体腔注射给药,分别于给药3天及7天后观察ES及其修饰物对脉络膜新生血管的抑制作用,并利用Western blotting检测了碱烧伤治疗后其血管内皮生长因子（VEGF）及色素上皮衍生因子（PEDF）的表达。用药3天后,CNV的面积分别为:PBS组18.14×10³μm²,ES组10.65×10³μm²,PEG-ES组8.92×10³μm²,LMWH-ES组9.02×10³μm²,PSH-ES组8.97×10³μm²,与ES相比较三种修饰产物其P值均小于0.05,显示ES及其修饰物组CNV的面积明显小于PBS组,且三种修饰物组CNV面积均小于ES组;用药7天后,CNV的面积分别为:PBS组23.28×10³μm²,ES组14.20×10³μm²,PEG-ES组11.93×10³μm²,LMWH-ES组12.74×10³μm²,PSH-ES组12.15×10³μm²,显示ES及其修饰物组CNV的面积明显小于PBS组,且三种修饰物组CNV面积均小于ES组,其P值均小于0.05。Western blotting结果表明,ES及其修饰物还能够明显地下调脉络膜VEGF的表达、上调PEDF的表达。ES及其修饰物能明显抑制斑马鱼模型体节间血管生成,与对照组相比具有显著性差异,其P值均小于0.05。在浓度分别为5μg/mL、10μg/mL和50μg/mL时,ES及其各修饰组对体节间血管的抑制率分别为:ES组13.21%、22.22%、41.74%,PEG-ES组18.62%、34.23%、49.25%,LMWH-ES组18.92%、31.53%、46.85%,PSH-ES组19.22%、39.64%、55.25%。三种修饰产物与ES相比,均具有更好的抑制活性,其P均＜0.05。ES及其修饰物对荷S₁₈₀肿瘤小鼠肿瘤的抑制作用实验显示,ES、PEG-ES、LMWH-ES、PSH-ES四组抑瘤率分别为40.50%、51.24%、61.98%和65.29%,三种修饰产物其体内抑制肿瘤活性均高于ES本身。5内皮抑素及其修饰物药代动力学及组织分布研究利用¹²⁵I放射性标记技术标记ES及其衍生物,并研究了其在小鼠体内的药代动力学参数和组织分布情况。结果表明,三种修饰后的蛋白PEG-ES、LMWH-ES和PSH-ES的消除半衰期分别为43.88 h、39.54 h和35.58 h,均明显长于原始ES蛋白的8.81 h,他们的分布半衰期也均长于ES本身,另外,修饰后的蛋白其血浆清除率明显低于ES,曲线下面积和一阶曲线下面积均高于ES,血浆保留时间也获得延长,说明三个修饰剂对ES的化学修饰均实现了延长其半衰期的效果。PSH-ES静脉注射后在肝组织具有较高的蓄积性,其他两种修饰产物与ES相比较组织分布情况差别不大。本研究取得的成果和结论主要有:（1）采用PEG、LMWH和PSH对ES进行化学修饰,实现了对PEG-ES、LMWH-ES和PSH-ES的分离纯化,获得了稳定性较好的ES修饰物。（2）运用CD技术对PEG-ES、LMWH-ES和PSH-ES的二级结构进行分析,发现PEG对ES的化学修饰对β-转角成分影响较大,LMWH和PSH修饰对其二级结构各成分影响不大。（3）运用流式细胞技术和激光共聚焦显微镜技术发现三种修饰剂修饰之后的ES与天然ES相比对内皮细胞的亲和性更强。（4）ES及其修饰物能够明显抑制HUVEC的增殖、CAM血管、斑马鱼体节间血管和激光致脉络膜血管的生长、荷瘤小鼠肿瘤的生长,且修饰物的效果更好。（5）ES的三种修饰产物体内半衰期均明显长于ES本身,其体内组织分布较ES具有微小变化。