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本文研究了PrP样蛋白Dp1神经细胞毒性及PrP蛋白神经保护活性的生物学特征，初步鉴定了两者各自的生物活性表位，部分阐明了Dp1与PrP的拮抗关系，Dp1细胞毒机制和诱导SH-SY5Y细胞凋亡的机制，这些工作将为深入研究prp的确切功能提供线索。对Dp1蛋白与PrP相互作用的研究还为朊病毒病发病机制的研究提供参考。
根据GenBank公布的人PRND cDNA序列设计合成特异性引物，用PCR方法从人外周血白细胞总DNA中扩增获得531 bp的人．PRND完整基因序列，测序正确后克隆至表达载体，转化大肠杆菌JMl09，IPTG诱导表达重组人Dpl(rhDpl)蛋白。目的蛋白以包涵体形式表达，表达量占菌体总蛋白的60％以上。表达产物用Ni<2+>亲和层析柱纯化及羟胺化学裂解法去除标签蛋白，SDS-PAGE检测证实，纯化的rhDpl蛋白相对分子量约为15 kD。TrypanBlue及MTT实验显示，在50μg/mL及以上剂量时，rhDp1蛋白具有抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞生长的作用，在100μg/mL及以上剂量时，rhDp1具有杀伤HeLa细胞的活性，呈现明显的剂量和时间依赖性。这些结果提示Dp1蛋白具有体外细胞毒作用，并呈现明显的组织类型特异性。为了解Dp1蛋白细胞毒性决定簇，对Dp1基因进行了分段原核表达，主要针对Dp1蛋白上的三个α螺旋及两个β折叠对其进行划分。采用纯化后的各种分段表达蛋白进行体外细胞毒性分析表明，其细胞毒性决定簇位于蛋白C端氨基酸81-122位，且与N端无规卷曲结构无关。
为研究正常朊蛋白(PrP)对Dp1蛋白细胞毒活性的影响，通过PrP蛋白与Dpl蛋白共处理人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后观察细胞的生长状况，并检测了二价铜离子对两者相互作用的影响，结果证明正常朊蛋白即全长野生型重组人PrP蛋白可明显拮抗Dp1蛋白引起的神经细胞毒活性，呈现明显的剂量和时间依赖性，有神经保护活性。且二价铜离子增强了PrP的神经保护作用。
为了解PrP蛋白上何种结构域对Dp1蛋白细胞毒活性起了拮抗作用，构建了多个截断及八肽插入突变体，包括N端小片段、N端大片段、C端片段，以及含有插入了4个额外及7个额外八肽重复序列全长PrP蛋白，在大肠杆菌中表达这些突变体蛋白。细胞毒活性分析后发现，野生型PrP对培养细胞的生长有一定促进作用，而PrP蛋白N端大片段氨基酸32-121位缺失，4个及7个八肽重复序列额外插入后具有神经细胞毒活性。进一步将各突变体蛋白与Dp1共处理人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞后观察细胞的生长状况，发现PrP蛋白上Dp1蛋白神经细胞毒性的拮抗部位位于PrP蛋白N端氨基酸的第23-90位。以上实验说明PrP蛋白N端无规卷曲结构具有神经保护作用。
为了进一步分析Dp1对人SH-SY5Y细胞的作用及机制，将重组人Dp1蛋白作用SH-SY5Y细胞，Hoechst33342染色可见细胞核染色质浓集，呈致密的强荧光，呈现出明显剂量依赖关系。DNA末端原位标记染色法(TUNEL)发现出现多量的阳性着色细胞。AnnexinV/PI双染实验均检测显示凋亡细胞数量明显增加。这些结果提示Dp1蛋白对SH-SY5Y细胞毒性作用可能是通过细胞凋亡机制。进一步观测Dp1蛋白细胞毒作用过程中细胞内活性氧的变化，将Cu/Zn超氧化物歧化酶和一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂L-NAME分布同时与Dp1蛋白导入SH-SY5Y细胞，观测对细胞生长的影响。结果发现L-NAME可明显抑制Dp1蛋白引起的神经细胞毒性，而加入Cu/Zn超氧化物歧化酶对Dp1蛋白诱导的SH-SY5Y细胞毒性作用无明显影响。同时我们还通过Western bloting检测发现Dp1蛋白刺激人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞过程中NOS及血红素氧化酶1(HO-1)的表达水平升高。这提示Dp1蛋白引起的神经细胞毒性可能是通过NOS及HO-1途径介导的。
随后，构建了人PRND基因及PRNP N端缺失(△32-121)突变基因真核表达质粒，转染SH-SY5Y细胞48 h后可检测到Dp1及PrP△32-121的表达。通过MTT方法检测细胞活力；采用丫啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色及DNA Ladder分析神经母细胞瘤细胞凋亡；罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位和活性氧水平变化；底物染色反应检测caspase-3活性；Western-blot分析线粒体相关蛋白的表达。结果发现重组质粒转染SH-SY5Y细胞48 h后，细胞活力明显下降；AO/EB染色可见明显的细胞凋亡形态学变化；与空质粒对照相比，线粒体跨膜电位下降和活性氧水平升高；caspase-3活性增强；凋亡细胞：Bcl-2蛋白表达水平明显下调，而Bax表达水平未见明显改变。以上结果提示，在SH-SY5Y细胞中瞬时表达人PRND基因及PRNP(△32-121)基因也可诱导出现细胞毒性作用。二级结构与Dp1相似的PrP突变体，PrP(△32-121)在体外培养细胞中可引起相似的作用，提示在蛋白结构与功能上存在着密切的联系。线粒体跨膜电位和Bcl-2下调， ROS水平上调，进而激活caspase-3，最终诱导了人SH-SY5Y细胞凋亡。
综上所述，