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目的NBS1是MRN复合物(MRE11/RAD50/NBS1复合物)中的重要基因,是DNA双链断裂修复中最重要的一个参与者。近年来一些研究表明MRN复合物对端粒酶阴性肿瘤细胞的生存维系起着重要的作用,NBS1功能受损会使MRN复合物解离,阻止其功能的发挥,破坏端粒酶阴性细胞同源重组介导的端粒长度维持机制(alternative lengthening of telomeres,ALT),导致其增殖受抑,它的过表达可以诱导转化和肿瘤发生,并与部分肿瘤预后有密切关系。关于NBS1与端粒酶机制的研究很少。最近有人研究显示MRN的减少能导致端粒酶阳性细胞中端粒G-overhangs长度的瞬时缩短。他们在端粒酶阴性细胞中发现Overhangs的长度没有减少,但是在给与外源性端粒酶表达后则发生,因此猜测MRN复合物可能涉及到了端粒酶的复原或激活。对头颈部恶性肿瘤的研究发现NBS1的表达水平与Akt的磷酸化水平相关,通过siRNA导致的内源性Akt表达的抑制可减少过表达NBS1的Ratla细胞的转化活性。还有研究者则认为NBS1是PI3K途径的配体或激活子。对于NBS1与ERK1/2信号通路的关系目前则尚无人研究。本研究利用RNA干扰领域一种新的研究手段和实验工具—microRNA干扰基因表达的方式,研究MRN复合物的重要成分——NBS1基因沉默与端粒酶阳性肿瘤细胞端粒酶活性之间的关系,并对PI3K/Akt及ERK1/2信号通路与NBS1基因沉默之间的关系进行探讨。方法1、靶向NBS1基因的microRNA序列的设计合成与构建选择NBS1基因mRNA序列中21nt片段为合适的microRNA靶序列,设计四个针对NBS1基因不同区域的64nt的pre-microRNA寡核苷酸序列,合成并构建入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体并转化至DH5α感受态大肠杆菌。重组体分别命名为NBS1mi-1,NBS1mi-2,NBS1 mi-3,NBS1mi-4。2、重组体的鉴定对重组体首先在LB平板上进行选择培养。挑取LB平板上的阳性克隆菌落,进行菌落PCR反应,琼脂糖电泳对重组体进行初步鉴定。阳性克隆菌株LB培养基中扩大培养,提取菌液质粒并纯化,送公司测序。3、细胞培养和转染选择70%以上汇合的Hela细胞,接种在培养板中。转染时细胞生长密度达到80%以上。实验分组为空载体对照,阴性对照(正常细胞组),NBS1mi-1,NBS1mi-2,NBS1mi-3,NBS1mi-4。每组设三个平行孔。4、转染效率检测收集转染12h后的细胞,进行报告基因GFP的Real-Time PCR实验确定转染效率。5、检测NBS1基因mRNA表达水平收集转染12h后的细胞,进行NBS1基因的Real-Time PCR实验确定其mRNA表达水平。6、Western blot检测NBS1基因蛋白表达水平收集转染24h后的细胞,Western blot检测NBS1mi-1,NBS1mi-2,NBS1mi-3,NBS1mi-4重组体转染组的NBS1基因蛋白表达水平,结合它们NBS1基因mRNA表达结果,选择一个对NBS1基因的表达干扰效果最佳的micro RNA真核表达重组载体进行下一步实验。7、TRAP-PCR-EB法检测细胞端粒酶活性检测microRNA介导的NBS1基因沉默对Hela细胞端粒酶活性的影响。8、MTT法绘制细胞生长曲线检测microRNA介导的NBS1基因沉默对Hela细胞增殖的影响。9、Western blot检测Akt,ERK1/2及其磷酸化蛋白表达水平检测microRNA介导的NBS1基因沉默与PI3K╱Akt及ERK1/2信号通路的关系。10、统计学处理实验结果以(?)±s表示,采用SPSS 13.0统计学软件进行T检验,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、设计出了四个靶向NBS1mRAN序列的microRNA序列经NCBI Blast已排除其非特异同源性,并能与pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体的粘性末端互补配对。2、重组体鉴定结果菌落PCR、琼脂糖电泳显示扩增出的片段大小为250bp左右,符合预期结果。初步证明pre-miRNA片段已正确定向插入到载体中。测序分析证明重组体中含有目的片段,且插入片段的碱基序列完整,没有碱基的突变以及丢失。3、转染效率Real-Time PCR分析结果显示,转染12h后阴性对照组、空载体对照组、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4的转染效率分别为(57.26±1.04)%、(55.41±3.68)%、(45.51±2.62)%、(47.55±1.35)%、(50.23±3.27)%、(43.56±2.56)%,经独立样本T检验分析,空载体对照组、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四个NBS1mi重组体组和阴性对照组相比转染效率的差异不显著(P＞0.05),它们彼此之间也没有显著差异(P＞0.05),这提示各组之间GFPmRNA的扩增循环数及起始模板数没有显著的不同,即转染效率没有显著的区别。4、NBS1基因mRNA表达水平的变化转染12h后阴性对照组、空载体对照组、NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4重组体组的NBS1基因mRNA表达量分别为0.86±0.16、0.78±0.16、0.24±0.17、0.12±0.12、0.41±0.97、0.48±0.93。NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四个重组体组的NBS1 mRNA表达水平和阴性对照组、空载体对照组之间相比较差异有显著性(P＜0.05)。而空载体对照组和阴性对照组的NBS1 mRNA表达水平无明显差异(P＞0.05)。NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四个重组体组中NBS1mi-2重组体组的NBS1 mRNA表达水平最低。5、NBS1基因蛋白表达水平的变化和阴性对照组相比,NBS1基因蛋白表达水平在NBS1mi-1、NBS1mi-2、NBS1mi-3、NBS1mi-4四个重组体中都有所降低,其中NBS1mi-2转染组的NBS1基因蛋白表达水平相对最低。而空载体对照组和阴性对照组相比则无明显变化。结合NBS1 mRNA表达的结果,可以确定在四个重组体中,NBS1mi-2重组体对NBS1基因的沉默效果最好。6、Hela细胞端粒酶活性的改变根据NBS1基因的mRNA及蛋白表达检测结果,选择干扰效果最好的NBS1mi-2重组体转染细胞检测细胞端粒酶活性变化。和阴性对照组相比,NBS1mi-2的24h、48h、72h转染组的Hela细胞端粒酶活性降低明显(P＜0.05)。且随着NBS1mi-2转染时间的延长,Hela细胞端粒酶活性也逐渐下降,NBS1mi-2转染72h后端粒酶活性的下降程度尤其显著(P＜0.01)。而空载体对照组与阴性对照组相比无明显变化。7、细胞生长状态的改变NBS1mi-2转染组和阴性对照组、空载体对照组相比Hela细胞的生长曲线明显趋缓,NBS1mi-2转染后Hela细胞的增殖速度变慢,细胞的增殖受到抑制。8、磷酸化Akt蛋白表达水平的变化和阴性对照组相比,NBS1mi-2转染组磷酸化Akt蛋白表达水平明显降低(P＜0.01),而空载体对照组和阴性对照组相比则无明显变化(P＞0.05)。Akt蛋白表达水平彼此之间无明显差异。9、磷酸化ERK1/2蛋白表达水平的变化和阴性对照组相比,NBS1mi-2转染组磷酸化ERK1/2蛋白表达水平明显降低,差异有显著性(P＜0.01)。而空载体对照组和阴性对照组相比则变化不显著(P＞0.05)。总ERK1/2蛋白表达水平彼此之间无明显差异。结论1、人工设计的靶向目的mRNA的pre-microRNA片段正确完整地插入到了pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体之中,靶向NBS1基因的microRNA真核表达载体的构建成功。2、各实验组之间的转染效率并不相同,但彼此之间并没有显著性差异,这就消除了因各组转染效率不同可能对其他各检测指标造成的误差。因此,靶向NBS1基因的microRNA真核表达载体转染成功。这为下一步实验奠定了基础。3、NBS1基因沉默能导致端粒酶阳性细胞Hela细胞中的端粒酶活性的抑制。4、NBS1基因沉默能导致端粒酶阳性细胞Hela细胞的增殖受抑制。5、microRNA靶向沉默NBS1基因后导致Akt蛋白和ERK1/2蛋白的磷酸化水平降低。6、综合以上结论,我们认为,NBS1基因被其靶向性的microRNA干扰其表达后,通过对PI3K/Akt信号通路和ERK1/2信号通路的共同抑制导致细胞端粒酶活性降低,端粒酶阳性细胞Hela细胞的增殖受抑制。NBS1基因有可能成为端粒酶阳性肿瘤基因治疗的新靶点。