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目的:本课题以丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,TSⅡA)为治疗药物。首先建立氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫大鼠模型,分别给予TSⅡA、丙戊酸钠,通过转录组测序分析TSⅡA在癫痫治疗中的潜在作用机制。同时建立无镁外液致痫海马神经元模型,通过LY294002抑制剂的干预,从细胞凋亡和突触可塑性损伤考察痫样放电状态下TSⅡA对海马神经元的保护作用以及对PI3K/Akt信号通路的调控作用,探讨TSⅡA对治疗癫痫的药理作用及其机制,为中药单体治疗癫痫方案提供理论依据和新思路。方法:1.通过氯化锂-匹罗卡品腹腔注射法构建并筛选造模成功的SD大鼠癫痫模型,将其随机分为模型组(Model)、丹参酮ⅡA给药组(TSⅡA,20 mg·kg-1)和丙戊酸钠给药组(VPA,200 mg·kg-1),空白组(Blank)的大鼠注射等量生理盐水。给药组连续灌胃对应药物60 d,其余各组给予等量生理盐水。各组随机麻醉3只大鼠,断头取脑,统一分离左侧海马组织进行总RNA提取,通过转录组测序检测各组海马内m RNA的表达情况。利用差异表达基因筛选、KEGG、GO等功能软件分析TSⅡA治疗癫痫的潜在作用机制。2.提取并培养SD乳鼠(新生24 h内)原代海马神经元,通过MAP2免疫荧光染色法分析海马神经元细胞纯度。待海马神经元培养至第9 d,用无镁外液干预3 h,建立无镁外液致痫海马神经元体外模型(用正常细胞外液干预3 h的细胞为空白组)。利用CCK8法筛选TSⅡA最佳给药浓度。之后实验组分为空白组(Blank)、模型组(Model)、丹参酮ⅡA给药组(TSⅡA,20μM)、LY294002给药组(LY294002,25μM)和TSⅡA+LY294002给药组(TSⅡA+LY294002,20μM+25μM)。3.给予对应药物干预并培养24 h后,利用CCK8法检测各组海马神经元的细胞活力。同时利用TUNEL染色法统计各组细胞凋亡率。利用Western Blot考察各组海马神经元细胞内p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax的表达情况。4.给予对应药物干预并培养24 h后,通过免疫荧光染色法,利用FIJI软件对海马神经元突起复杂程度以及突起总长度定量分析,并统计一级树突量和树突棘密度,分析细胞内Drebrin、BDNF蛋白的表达情况。利用Western Blot测定各组海马神经元细胞内p-Akt/Akt、BDNF、SYN及PSD-95蛋白的表达情况。结果:1.转录组测序结果表明,Blank-vs-Model与TSⅡA-vs-Model比较组间共同差异表达基因255个,排除与VPA-vs-Model比较组有关的89个共同差异基因,得到166个共同差异表达基因。经KEGG信号通路得到,166个差异表达基因显著富集于6个KEGG通路上(Pvalue<0.05),其中包括PI3K/Akt信号通路。同时经GO功能分析具有统计学差异的GO terms共441条(Pvalue<0.05),包含细胞组分44条、分子功能101条和生物过程296条。2.成功分离、培养原代海马神经元,神经元纯度为95%以上。CCK8法筛选得到TSⅡA最佳给药浓度为20μM,其细胞活力为90.7%±2.7%,与Model组相比细胞活力明显上升(P<0.01),与TSⅡA组相比LY294002、TSⅡA+LY294002组细胞活力明显下降(P<0.01)。3.TUNEL染色结果显示,TSⅡA组与Blank组无明显差别(P>0.05),与Model组相比明显降低(P<0.01)。与TSⅡA组相比,LY294002和TSⅡA+LY294002组的凋亡率明显升高(P<0.01)。4.Western Blot结果显示,TSⅡA组p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax表达量的比值较Model组显著升高(P<0.01)。LY294002和TSⅡA+LY294002组p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax表达量的比值较TSⅡA组显著下降(P<0.01)。5.Sholl分析得到TSⅡA能显著改善癫痫所致海马神经元的突起复杂程度、一级树突数量、突起总长度和树突棘密度的降低(P<0.05)。免疫荧光结果表明,与Model组相比,TSⅡA组内Drebrin、BDNF蛋白表达水平显著上升(P<0.05);与TSⅡA组相比,LY294002和TSⅡA+LY294002组内其表达水平显著下降(P<0.05)。6.Western Blot结果显示,与Model组相比,TSⅡA组内BDNF、SYN、PSD-95和p-Akt/Akt蛋白表达水平都得到了显著的改善(P<0.01);与TSⅡA组相比,LY294002和TSⅡA+LY294002组内BDNF、SYN、PSD95和p-Akt/Akt蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论:TSⅡA可以通过PI3K/Akt信号通路调节匹罗卡品-氯化锂致痫大鼠体内基因的表达,同时能够调节该通路有效的改善无镁外液所致癫痫持续状态下引起的海马神经元细胞的凋亡和突触可塑性损伤。