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目的:血管平滑肌细胞的迁移和增殖在动脉粥样硬化、血管术后再狭窄等心血管疾病中具有重要作用。影响血管平滑肌细胞的迁移和增殖的信号转导通路很多,其中在RhoA/ROCK信号转导通路中,ROCK通过使其下游的蛋白质磷酸化,间接地调控肌动蛋白的聚合和解聚以及与肌球蛋白的相互作用,最终影响细胞的迁移。研究还发现ROCK能通过调节细胞周期蛋白的表达来调控细胞周期的进行,从而影响血管平滑肌细胞的增殖。ROCK有两种亚型包括ROCK1和ROCK2,两者的氨基酸序列具有65%的同源性,其中激酶区的同源性高达92%。因此,一般认为两者在细胞内的功能相同。然而,近年来研究发现ROCK1和ROCK2在某些细胞中具有不同的磷酸化底物和细胞功能。目前,ROCK的两种亚型在血管平滑肌细胞的迁移和增殖的作用是否相同尚不清楚。本研究旨在研究ROCK亚型(ROCK1和ROCK2)在血管平滑肌细胞迁移和增殖中的作用及其分子机制。方法:(1)利用RNA干扰原理,通过脂质体转染特异性针对ROCK亚型的人工合成的siRNA,使ROCK1和ROCK2表达分别下调,观察ROCK1和ROCK2对PDGF诱导的血管平滑肌细胞(A7r5)迁移和血清刺激的增殖是否具有相同的作用;(2)使用ROCK的特异抑制剂Y-27632同时抑制ROCK1和ROCK2的激酶活性,观察ROCK对细胞迁移和增殖的影响;(3)用蛋白免疫印迹技术检测蛋白的表达情况;(4)使用Boyden Chamber法观察ROCK1和ROCK2表达下调后对血管平滑肌细胞迁移的影响;(5)使用MTT法检测ROCK激酶表达下调后血管平滑肌细胞的生长曲线,并用流式细胞仪通过PI染色法分析经血清饥饿法同步化的细胞中各细胞周期时相的变化。结果:(1)ROCK1和ROCK2在血管平滑肌细胞中的蛋白表达水平不同,ROCK2的表达水平是ROCK1的8倍;(2)做细胞迁移实验时,通过转染siRNA使ROCK1和ROCK2的表达分别下调83.4%和94.7%;(3)ROCK1表达下调后,抑制了血管平滑肌细胞的迁移,而ROCK2表达下调后对细胞的迁移无明显影响,ROCK活性被Y-27632抑制后也抑制了细胞的迁移;(4)ROCK1表达下调导致LIMK的磷酸化水平降低,ROCK2表达下调后对LIMK磷酸化水平无明显影响,Y-27632抑制ROCK活性后LIMK的磷酸化水平也降低;(5)ROCK1表达下调后导致MLC磷酸化水平增加,ROCK2表达下调后对MLC磷酸化水平无明显影响,Y-27632抑制ROCK活性也可使MLC磷酸化水平也增加;(6)转染siRNA后,ROCK1和ROCK2两组之间细胞的生长无明显差别,而且细胞周期G1/S期的转化也无明显变化,而Y-27632抑制ROCK活性后G1/S期的转化受到抑制。结论:(1)在ROCK的两种亚型中,ROCK1在血管平滑肌细胞的迁移中起了主导作用,ROCK2对血管平滑肌细胞的迁移的调节作用不明显;(2)ROCK1通过下调LIMK的磷酸化,上调MLC的磷酸化途径调控血管平滑肌细胞的迁移;(3)ROCK1和ROCK2对血管平滑肌细胞的增殖具有相同的作用。