基于自噬机制研究黄芪甲苷对类AD大鼠学习记忆的影响

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jielonglong
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目的:  探讨基于自噬机制黄芪甲苷对类AD大鼠学习记忆的影响。  方法:  在体内实验中,将100只重250±20克的3月龄雌性雌性SD大鼠随机分为5组,即正常组,模型组,黄芪甲苷组,黄芪甲苷与3-MA组(3-MA即3-methyladenine,是一种自噬抑制剂),黄芪甲苷与RAPA组(RAPA即rapamycin,是一种自噬激动剂),建造阿尔兹海默症的大鼠模型。于术后第2天,给正常组与模型组注射0.9%生理盐水,给黄芪甲苷注射黄芪甲苷单体(黄芪甲苷终浓度为20mg/kg/d),给黄芪甲苷与3-MA组注射黄芪甲苷加自噬抑制剂3-MA(3-MA终浓度为5mg/kg/d),给黄芪甲苷与雷帕霉素组注射黄芪甲苷加自噬激动剂雷帕霉素(RAPA注射液终浓度为1.5μg/kg/d),治疗第6天,我们对所有大鼠进行Morris水迷宫的熟悉实验,在第7天正式开始Morris水迷宫的实验记录,对类AD大鼠进行定位航行实验和空间探索实验。治疗14天结束后,提取大鼠大脑进行HE染色实验以查看各组大鼠大脑基本形态;尼氏染色实验以查看神经细胞尼氏小体的情况;硫磺素T染色以查看易聚集蛋白情况;cleaved caspase-3和beclin-1的免疫组化以查看各组大鼠脑内凋亡水平与自噬水平;Tunel染色以查看凋亡水平;蛋白免疫印迹试验以检测Aβ,β APP, cleaved caspase-3, bcl-2, bax, LC3, p62, beclin-1蛋白的水平。在体外实验中,我们将PC12细胞分为5组,分组与上相同,用终浓度为10 mmol?L-1的Abeta25-35予以细胞造模,用终浓度为100 nmol?L-1的黄芪甲苷、终浓度为5 mmol?L-1的3-MA、终浓度为5μmol?L-1的雷帕霉素为之造模,敷育24小时后进行CCK-8实验检测各组细胞的生长情况;结晶紫染色检测各组细胞的生存率;LC3的免疫荧光实验检测自噬水平;Tunel实验和cleaved caspase-3的免疫组化实验检测凋亡水平;蛋白免疫印迹试验检测Aβ,β APP, cleaved caspase-3, bcl-2, bax, LC3, p62, beclin-1蛋白的水平。  结果:  ⑴空间导航实验中正常组的大鼠寻找站台的时间下降最快,模型组寻找站台的时间下降速度比正常组慢(P<0.05),黄芪甲苷组比模型组的下降速度快(P<0.05),同时,黄芪甲苷与RAPA组的比黄芪甲苷组的下降速度快,下降速度最慢的是黄芪甲苷与3-MA组(P<0.05,P<0.05),此外正常组的老鼠穿越站台的次数比模型组次数多,黄芪甲苷组的老鼠比模型组多。黄芪甲苷与RAPA组比黄芪甲苷组的老鼠多,同时黄芪甲苷与3-MA组的比黄芪甲苷组少。⑵在beclin-1, LC3II/LC3I蛋白抗体的表达上,正常组是最少的,模型组比正常组多一些,黄芪甲苷组的表达比模型组和黄芪甲苷与3-MA组要多(P<0.05, P<0.05),黄芪甲苷组和含有自噬激动剂雷帕霉素的黄芪甲苷与RAPA组对LC3蛋白抗体的表达量比其他组别要多出许多,黄芪甲苷与RAPA组的表达量是最多的,比黄芪甲苷组的表达量要多很多(P<0.05),p62则相反。⑶细胞内易聚集蛋白相关的蛋白抗体的蛋白免疫印迹实验,根据曝光机及其软件的精密计算,模型组PC12细胞表达Abeta25-35和β APP的含量多余正常组,而黄芪甲苷组的表达量比模型组要少很多(P<0.05,P<0.05),不仅如此,相比于黄芪甲苷组的表达量,黄芪甲苷与RAPA组的表达量明显少很多,同时,黄芪甲苷与3-MA组的表达量比黄芪甲苷组的含量要多。⑷模型组bax蛋白抗体和cleaved caspase-3蛋白抗体的表达量比正常组和黄芪甲苷组多(P<0.05),黄芪甲苷与RAPA组比黄芪甲苷组少许多,同时黄芪甲苷与3-MA组比黄芪甲苷组多许多,正常组是最少的(P<0.01,P<0.05),bcl-2蛋白抗体的表达量比正常组和黄芪甲苷组明显少(P<0.05),黄芪甲苷与RAPA组比黄芪甲苷组要多,而黄芪甲苷与3-MA组比黄芪甲苷组少非常多,在5组中,黄芪甲苷与3-MA组的表达量是最少的,正常组的表达量是最多的。(P<0.01, P<0.01)  结论:  ①黄芪甲苷可以提高自噬水平从而消除大鼠脑内易聚集蛋白。②黄芪甲苷可以提高自噬水平从而抑制细胞凋亡,由此提高AD大鼠脑内神经细胞的存活率。③黄芪甲苷可以提高自噬水平从而改善大鼠的学习和记忆能力。
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