第一部分成釉细胞瘤BRAF癌基因突变的检测目的:成釉细胞瘤是临床上较为常见的牙源性上皮性肿瘤,累及上、下颌骨及牙龈,关于成釉细胞瘤的分子病理与肿瘤生物学行为的关系,迄今认识较少。鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)是人类最重要的原癌基因之一。本实验采用变性高效液相色谱分析技术,DNA核酸序列测定技术检测成釉细胞瘤BRAF基因突变,探讨BRAF基因突变与成釉细胞瘤的临床病理及生物学行为之间的关系,为成釉细胞瘤分子病理研究及靶向治疗提供参考依据。方法:1临床资料30例成釉细胞瘤均为手术切除的新鲜标本。每例标本一部分经10%福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,厚度为4mm,用做病理诊断;另一部分立即冻入液氮,存放于-80?C冰箱备用。所有病例具有完整的临床病理资料。另取10例人正常牙龈黏膜作为对照。2 DNA模板的制备按QIAamp DNA Mini Kit试剂盒说明操作。3引物设计与合成根据BRAF基因V600E设计错配引物(BRAF M),引物3’端包含一个错配位点,野生型无法扩增,选择血栓素A合酶1(thromboxane A synthase 1,TBXAS1)基因作为内参基因,与BRAF V600E特异性突变产物长度有差异,用于变性高效液相色谱分析。设计BRAF基因第15外显子包含V600E突变位点的引物(BRAF N)进行测序分析。按照引物设计合成原则用Primer premier5.0软件设计引物。4聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)多重PCR反应体系如下:BRAF基因和TBXAS1基因在一个扩增体系内进行多重PCR,多重PCR反应体积25μl。PCR反应体系:Go Taq绿色体系Mix 12.5μl,BRAF M、TBXAS1上下游引物各0.5μl(0.2μM),DNA模板1μl(50ng),加无核酸酶水9.5μl。扩增循环参数如下:95?C预变性5分钟,94?C 30秒,54?C 30秒,72?C 30秒,30次循环,72?C延伸10分钟。50μl PCR反应体系如下:Go Taq绿色体系Mix 25μl,BRAF N上下游引物各1.5μl(0.3μM),DNA模板5μl(250ng),加无核酸酶水17μl。扩增循环参数如下:95?C预变性2分钟,95?C 30秒,58?C 30秒,72?C 30秒,30次循环,72?C延伸10分钟,PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳,60V 2.5小时,凝胶成像系统观察并照相。5变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)PCR产物在95?C下变性10分钟,然后逐渐降至室温,储存在4?C直至DHPLC分析。PCR产物直接进样于DNASep?核酸分析柱,平衡柱内置0.1mol/L三乙基乙酞胺,设定固定流速0.9ml/分钟,随着缓冲液乙晴浓度逐渐升高,DNA依次从固相柱上洗脱下来,设定流动相A液和B液的配合比例,分析温度50?C,设定紫外检测波长260nm,WAVEMAKERTM软件分析结果。6 DNA序列测定DNA琼脂糖切胶纯化按SK1131胶纯化试剂盒说明操作(Sangon Biotech Co,Ltd.Shanghai)。取0.2ml的PCR管,5μl PCR反应体系:Big Dye Mix 1μl,待测的PCR产物1μl,待测DNA的正向引物1μl,无酶去离子水2μl,在冰上操作。仅更换待测DNA的反向引物1μl,其余不变。将PCR管置于BBI PCR仪上进行扩增。98?C变性2分钟后进行PCR循环,PCR循环参数为96?C 10秒,50?C 5秒,60?C 4分钟,25个循环,扩增结束后设置4?C保存。将混合物离心,将扩增产物转移到1.5ml离心管中。加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10分钟以沉淀DNA。12000rpm于4?C离心30分钟,弃上清。加70%的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12000rpm于4?C离心5分钟,弃上清,真空干燥沉淀15分钟。加入12μl的纯化产物于离心管中,振荡让其充分溶解DNA沉淀,短暂离心。移液至0.2ml PCR管中,短暂离心。热变性95?C 2分钟,冰中骤冷。上机操作按仪器操作说明书安装毛细管,建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管,电泳结束后仪器会自动分析并打印出彩色测序图谱,突变情况以测序为准。此步骤交上海生工生物工程股份有限公司完成。7统计学处理应用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理,采用c2检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1临床病理资料分析30例成釉细胞瘤均经病理确诊。其中男性16例,女性为14例;年龄介于15~60岁,平均年龄为33.8岁。发病部位27例位于下颌骨,3例位于上颌骨。纳入研究的成釉细胞瘤按2005年WHO头颈部肿瘤病理学与遗传学的分类标准进行分型:滤泡型10例,丛状型9例,单囊型11例。其中肿瘤细胞密集,增殖活跃7例,肿瘤侵犯包膜5例,肿瘤术后复发11例。2 DHPLC分析30例成釉细胞瘤中,BRAF第15外显子PCR扩增后均显示与正常牙龈黏膜一样的电泳条带。DHPLC分析BRAF基因V600E突变,出现两个洗脱峰。位于左侧的洗脱峰为内参TBXAS1基因扩增产物,片段大小100bp;位于右侧的洗脱峰为BRAF基因突变检测扩增产物,片段大小126bp。30例成釉细胞瘤中,DHPLC分析显示18例波形呈双峰,显示V600E突变。3 BRAF基因突变情况DNA测序发现30例成釉细胞瘤有18例出现BRAF第15外显子1799核苷酸位点处,单个碱基发生胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)的错义突变,导致翻译蛋白600位密码子的缬氨酸(valine)被谷氨酸(glutamic acid)取代。应用Poly Phen2和SIFT基因组在线软件对这个氨基酸的改变评估后结果是可能破坏蛋白的表达。4 BRAF基因突变与临床病理的关系BRAF基因突变与患者的年龄、性别、生长部位、组织学类型、包膜侵犯的关系无统计学意义,而与肿瘤细胞增殖活跃、临床复发相关。肿瘤细胞增殖活跃的病例BRAF基因突变率高于不活跃的病例,二者差别有显著性(P<0.05),临床复发病例BRAF基因突变率高于未复发的病例,二者差别有显著性(P<0.05)。第二部分成釉细胞瘤SMO癌基因突变的实验研究目的:成釉细胞瘤是一种常见的良性牙源性肿瘤,但存在局部侵袭性生长和较高的临床复发率。Sonic hedgehog(SHH)信号通路被认为在牙胚生长发育中重要调控作用的信号通路,smoothened(SMO)癌基因编码的SMO蛋白是SHH信号通路中的信号转换器。本实验采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析结合DNA核酸序列测定技术检测成釉细胞瘤SMO基因突变的情况,以探讨SMO基因突变与成釉细胞瘤临床病理和生物学行为的关系。方法:1临床资料30例成釉细胞瘤均为手术切除的新鲜标本。每例标本一部分经10%福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,厚度为4mm,用做病理诊断;另一部分立即冻入液氮,存放于-80?C冰箱备用。所有病例具有完整的临床病理资料。另取10例人正常牙龈黏膜作为对照。2 DNA模板的制备按QIAGEN DNA Mini kit试剂盒说明操作。3引物设计与合成根据SMO基因各外显子序列按照引物合成原则并参考文献设计用Primer premier5.0软件设计引物。4 PCR反应PCR反应体系如下:Go Taq绿色体系Mix 25μl,SMO上下游引物各1.5μM,DNA模板250ng,无核酸酶水17μl。扩增循环参数如下:95?C预变性2分钟,95?C 30秒,55~60?C 30秒,72?C 30秒,30次循环,72?C延伸10分钟,PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳,60V 2.5小时,凝胶成像系统观察并照相。5单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)取5μl PCR扩增产物与变性上样液按1:1的比例加入0.5ml离心管中,混匀。上样前95?C变性10分钟,立即冰浴骤冷,低温瞬时离心,取变性样品6μl,以微量加样器上样。冷库中电泳,电泳液温度保持4?C。250V 5分钟,之后调整电压60V,电泳12~14小时。取出聚丙烯酰胺凝胶胶板,双蒸水冲洗3次,约15秒,凝胶置于银染固定液中固定6分钟,双蒸水清洗10秒×3次,0.1%Ag NO3染液20分钟,双蒸水洗3~5次,显色液中显色7分钟,以上步骤均在摇床中进行,避光,终止液中10分钟,再用水冲洗即可,扫描胶片记录结果。结果判断:每次电泳都以正常牙龈黏膜扩增产物作对照,若肿瘤标本出现电泳条带的增多、减少或位置的迁移,即为异常泳动条带,说明该样本中存在基因突变。6 DNA序列测定7统计学处理应用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理,采用c2检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1临床病理资料分析结果同第一部分。2 PCR-SSCP分析30例成釉细胞瘤组织中,各外显子PCR扩增后均显示与正常牙龈黏膜一样的电泳条带。SSCP银染后,第3外显子出现9例异常电泳条带,第5外显子出现10例异常电泳条带,第6外显子出现12例异常电泳条带,第10外显子出现5例电泳条带,其余外显子未出现异常电泳条带。3 SMO基因突变情况DNA测序发现30例成釉细胞瘤突变结果:第2外显子出现1例单碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)的同义突变,表现为176位氨基酸均为谷氨酸(glutamic acid);第3外显子出现9例单碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)的同义突变,表现为194位氨基酸均为谷氨酸(glutamic acid);第5外显子有11例单碱基突变,其中5例单碱基胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)的错义突变,导致翻译蛋白364密码子的苏氨酸(threonine)被天冬酰胺(asparagine)取代,有6例单碱基鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的同义突变,表现为379位氨基酸均为丙氨酸(alanine);第6外显子出现12例单碱基胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的同义突变,表现为383位氨基酸均为甘氨酸(glycine);第10外显子出现6例单碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的错义突变,导致翻译蛋白590密码子的丝氨酸(serine)被苏氨酸(threonine)取代。应用Poly Phen2和SIFT基因组在线软件对第364密码子的改变评估后结果是可能损伤蛋白的表达;对第590密码子改变Poly Phen2结果是很可能破坏蛋白的表达,而SIFT结果对蛋白表达影响是可容忍的。4 SMO基因突变与临床病理的关系SMO基因突变与患者的性别、部位、组织学类型和肿瘤临床复发之间的关系无统计学意义,而与年龄、增殖活跃,包膜侵犯密切相关。小于和等于20岁患者SMO基因突变率高于20岁以上患者,差别有显著性(P<0.05)。肿瘤细胞增殖活跃者突变率高于不活跃者,二者差别有显著性(P<0.05)。肿瘤细胞包膜内侵犯的SMO基因突变率高于未侵犯包膜者,二者差别有显著性(P<0.05)。第三部分成釉细胞瘤RECK抑癌基因突变及蛋白表达研究目的:肿瘤的发生是一个多阶段,多因素参与的过程。伴Kazal域的富半胱氨酸反向诱导蛋白(reversion inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs,RECK)基因是近来研究热点集中的较新的抑癌基因。可以负性调控基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),从而抑制MMPs降解细胞外基质的作用。本实验采用DNA核酸序列测定技术,应用Western blot检测30例成釉细胞瘤RECK基因突变及RECK蛋白和MMP-9蛋白表达情况,与临床病理资料对比分析,以探讨RECK基因突变与成釉细胞瘤临床病理和生物学行为之间的关系。方法:1临床资料30例成釉细胞瘤均为手术切除的新鲜标本。每例标本一部分经10%福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,厚度为4mm,用做病理诊断;另一部分立即冻入液氮,存放于-80?C冰箱备用。所有病例具有完整的临床病理资料。另取10例人正常牙龈黏膜作为对照。2 DNA模板的制备按QIAGEN DNA Mini kit试剂盒说明操作。3引物设计与合成根据RECK基因1,8,9,11,13,15外显子序列按照引物合成原则并参考文献用Primer premier5.0软件设计引物。4 PCR反应PCR反应体系如下:Go Taq绿色体系Mix 25μl,RECK上下游引物各1.5μM,DNA模板250ng,无核酸酶水17μl。扩增循环参数如下:95?C预变性2分钟,95?C 30秒,58~60?C 30秒,72?C 30秒,30次循环,72?C延伸10分钟,PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳,60V 2.5小时,凝胶成像系统观察并照相。5免疫印迹(Western blot)取冷冻肿瘤组织标本进行组织总蛋白的提取,按照BCA蛋白定量试剂盒说明进行蛋白定量,计算待测样品的蛋白浓度。配胶与灌胶,蛋白变性上样,电泳,转膜,预染,封闭,一抗孵育,二抗孵育,化学发光法检测,用Gene Tool from Syngene software图像分析软件分析目的和内参条带灰度值,计算出相对蛋白表达量。6 DNA序列测定7统计学处理应用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理,采用c2检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。Western blot实验数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,单因素方差分析对实验结果进行分析,P<0.05差异具有统计学意义。结果:1临床病理资料分析结果同第一部分。2 RECK基因突变情况30例成釉细胞瘤组织中,第1,8,9,11,13,15外显子PCR扩增后均显示与正常牙龈黏膜一样的电泳条带。DNA测序发现30例成釉细胞瘤突变结果:第1,8外显子未发现突变位点;第9外显子出现11例单碱基鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的错义突变,导致翻译蛋白275位密码子的缬氨酸(valine)被异亮氨酸(isoleucine)取代;第11外显子有3例单碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)的错义突变,导致翻译蛋白395密码子的异亮氨酸(isoleucine)被缬氨酸(valine)取代;第13外显子出现12例单碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)的同义突变,表现为520位氨基酸均为脯氨酸(proline);第15外显子出现11例单碱基胸腺嘧啶(T)和腺嘌呤(A)的同义突变,表现为翻译蛋白625位氨基酸均为精氨酸(arginine)。应用Poly Phen2和SIFT基因组在线软件对第275密码子的改变评估后结果是可能损伤蛋白的表达;对第395密码子的改变评估后结果是对蛋白表达的影响是良性的。3 Western blot检测RECK蛋白和MMP-9蛋白在成釉细胞瘤中的表达与RECK基因突变的关系:Gene Tool检测Western blot样本条带相对定量分析结果显示:RECK突变组,RECK蛋白相对表达量为0.43±0.08,MMP-9蛋白相对表达量为0.83±0.07;未突变组RECK蛋白相对表达量为0.66±0.06,MMP-9蛋白相对表达量为0.63±0.05;正常牙龈组,RECK蛋白相对表达量为0.87±0.06,MMP-9蛋白相对表达量为0.49±0.05。统计学分析显示RECK蛋白在突变组表达低于未突变组,二者差别有显著性(P<0.05),突变组和未突变组蛋白表达均低于正常牙龈组,差别均有显著性(P<0.05)。MMP-9蛋白在RECK突变组表达高于未突变组,二者差别有显著性(P<0.05),突变组和未突变组蛋白表达均高于正常牙龈组,差别均有显著性(P<0.05)。4 RECK基因突变与临床病理的关系RECK基因突变与患者的年龄、性别、生长部位和组织学类型之间的关系无统计学意义,而与增殖活跃,包膜侵犯和肿瘤复发密切相关。肿瘤细胞增殖活跃者突变率高于不活跃者,二者差别有显著性(P<0.05)。肿瘤细胞包膜内侵犯的SMO基因突变率高于未侵犯包膜者,二者差别有显著性(P<0.05)。临床复发病例突变率高于未复发病例,二者差别有显著性(P<0.05)。结论:1成釉细胞瘤BRAF基因突变表现为V600E突变,突变率60%。2 BRAF基因V600E突变和成釉细胞瘤的增殖活跃状态和肿瘤临床复发密切相关。3成釉细胞瘤SMO基因突变主要发生在第2,3,5,6,10外显子单碱基发生,错义突变热点在第364,590密码子,其中T364N对蛋白异常表达的影响占主要作用。4 SMO基因突变年轻患者发生率高,与成釉细胞瘤肿瘤细胞增殖活跃和包膜内侵犯密切相关。5成釉细胞瘤RECK基因第9,11,13,15外显子突变为单碱基发生。其中错义突变热点为第275,395密码子,其中V275I对蛋白异常表达影响占主要作用。6成釉细胞瘤RECK基因突变与肿瘤细胞增殖活跃,包膜内侵犯和肿瘤临床复发密切相关。RECK蛋白的低表达与基因突变关系密切。