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侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)S62-9 产生的抗菌肽(Brevibacillin,BBL),有抑菌谱广,耐热性良好,不宜残留,不产生抗药性等特点,因此抗菌肽BBL在食品抑菌防腐领域有良好的应用前景。抗菌肽BBL为非核糖体肽(nonribosomal peptides,NRPs),合成由相关基因簇决定,而且是非核糖体肽合成酶为核心模块结构。本文研究将异源表达合成抗菌肽的一个NRPs核心模块,通过检测非核糖体肽合成酶腺苷化结构域上载氨基酸的活性,探索NRPs模块在合成抗菌肽BBL中的作用,为今后构建抗菌肽合成的全模块,并为实现体外大量合成抗菌肽BBL奠定基础。本文主要研究结果如下:(1)侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽BBL的合成基因簇包含了非核糖体肽合成酶腺苷化结构域(adenylation domain,NRPS-A)、酰基载体蛋白结构域(acyl aarrier protein domain,ACP)两个核心元件的基因序列,以及差向异构酶、甲基转移酶、糖基修饰酶等其他修饰元件的基因序列;利用基因组挖掘技术分析出非核糖体肽合成酶的核心元件为C-A-PCP。由于侧孢短芽孢杆菌S62-9产生的抗菌肽BBL的合成基因簇缺乏缩合结构域(condensation domain,C domain),因此从侧孢短芽孢杆菌S62-9基因组上克隆了一个C结构域的基因,C结构域的理论分子量为35.8kDa;A结构域的理论分子量为59.9kDa;ACP结构域的理论分子量为9.6kDa;(2)以A结构域的编码基因为供试基因,与载体pET-21b和pET-22b构建了四个重组表达载体 pET21b-N1、pET21b-B2、pET22b-N1、pET22b-N3,然后分别转化E.coli BL21、E.coli Rosetta(DE3)、E.coli Origami B(DE3)受体细胞,经 IPTG诱导后,只有载体pET22b-N3在E.coli Origami B(DE3)中表达出了有活性的融合蛋白,是以可溶性形式出现的,而其他的融合蛋白是以没有活性的包涵体,因此选择pET-22b作为表达载体,E.coli Origami B(DE3)作为异源表达的受体。(3)分别将C、ACP结构域以及C-A-ACP合成模块与pET-22b载体构建了重组表达载体 pET-22b-S4、pET-22b-B5、pET-22b-B5-N3-S4,并将 pET-22b-S4、pET-22b-B5、pET-22b-B5-N3-S4三个重组表达载体转化E.coli Origami B(DE3)受体细胞,C结构域和ACP结构域的重组表达载体以及合成模块经诱导表达后最终只出现了分子量大概为35.8kDa、9.6kDa、105.3kDa的包涵体,这些包涵体没有展示出生物活性。(4)利用焦磷酸试剂盒检测A结构域的底物特异性,并测定基本酶学动力参数。结果发现腺苷化结构域对赖氨酸显示出了高的生物活性,对其他供试氨基酸显示出的活性极低,说明该腺苷化结构域能特异性的上载赖氨酸,并可以将赖氨酸磷酸化。腺苷化结构域的最适作用温度为35℃,最适作用pH为7,Km值为8.793 μmol/L,Vmax值为 6.811 μmol/L·min。