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第一部分椎间盘脱细胞方法及效果评估目的：评估多种新西兰白兔椎间盘脱细胞方法其脱细胞效果以及新西兰白兔椎间盘经脱细胞后生物化学性质里力学性质方法：我们从4月龄新西兰白兔中收集了45例胸椎及腰椎椎间盘标本,用作体外实验。新西兰白兔椎间盘周围的肌肉组织及骨片被剔除干净,切去软骨终板保留髓核和纤维环,并在PBS中清洗以洗去多余的血液。处理后的椎间盘标本立刻冻存于液氮中以备后用。将标本分为不作脱细胞处理的阴性对照组和行脱细胞组的A组以及B组。A组脱细胞方法：在37摄氏度水浴和液氮中反复溶冻5次,在2%Triton X-100中浸泡24小时,在1%SDS溶液中浸泡24小时,后以200U/mlDNA酶处理2小时,处理后在PBS中清洗以洗去残余试剂；B组脱细胞方法：在37摄氏度水浴和液氮中反复溶冻5次,在3%Triton X-100中浸泡24小时,在2%SDS溶液中浸泡24小时,处理后在PBS中清洗以洗去残余试剂.所有标本均以H&E和Alican蓝染色,以免疫组织化学检测椎间盘中Collagen type Ⅰ, Collagen type Ⅱ以及Aggrecan保存量,以DNeasy Blood & Kit试剂盒按生产商说明书处理提取DNA,用NanoDrop8000检测DNA含量,以吸光度比色法检测HYP含量,根据以上结果确定适宜脱细胞方案,排除不适宜组,以冻干法使标本脱水,以质量变化推测含水量。以SEM及TEM检测对照组及适宜脱细胞法组的微观结构。将脱细胞材料分为纤维环及髓核和两部分,适用电脑控制检测装置以检测纤维环弹性模量,最大张力以及最大压力,检测髓核压缩模量。结果：A组和对照组在H&E和Alican蓝染色,各项免疫组织化学结果中无明显差异,B组则与对照组之间存在明显差异；A组中HYP含量最高,对照组次之,B组中HYP含量最低,且三者存在明显差异,A组方法为适宜椎间盘脱细胞方法。A组含水量明显高于对照组,两者SEM以及TEM结果无明显差异；A组与对照组的弹性模量,压力模量,最大压力以及最大延长度均无明显差异。结论：在37摄氏度水浴和液氮中反复溶冻5次,在2%Triton X-100中浸泡24小时,在1%SDS溶液中浸泡24小时,后以200U/mlDNA酶处理2小时,处理后在PBS中清洗以洗去残余试剂是新西兰白兔适宜的椎间盘脱细胞方法。这种方法可以最大程度上的保留椎间盘原有的生物化学特点,微观结构以及力学特点。第二部分同种去细胞椎间盘材料安全性评估目的：评估同种去细胞椎间盘材料分别在体内及体外的安全性。方法：为评估同种去细胞椎间盘材料分别在体内及体外的安全性,我们将新西兰白兔椎间盘标本分为实验组及对照组,实验组按第一部分中得出的适宜的椎间盘脱细胞方法进行处理,对照组不予处理,分别植入新西兰白兔脊柱两侧皮下,1月后去除实验组及对照组,所有标本均以HE染色观察中性粒细胞分布,以免疫组织化学检测MAC387及CD8水平观察巨噬细胞及细胞毒T细胞水平。以梯度离心法收集新西兰白兔MSC,将去细胞椎间盘材料置于DMEM-HG中,放置于培养箱48小时,收集浸提液,将MSC培养于含FBS10%的DEME-HG(对照组),25%浸提液+DMEM-HG,50%浸提液+DMEM-HG和100%浸提液中培养,以活死细胞染色观察存活细胞,以CCK-8试剂盒及吸光度比色计观察细胞活力。将MSC种植按第一部分方法脱细胞的新西兰白兔椎间盘材料上,分别在第3天,第7天,第14天,第21天以活死细胞染色观察存活细胞,以H&E染色观测材料结构以及MSC分布。结果：经第一部分适宜脱细胞方法处理后的新西兰白兔椎间盘材料在植入同种白兔皮下后未见明显中性粒细胞,巨噬细胞,细胞毒性T细胞浸润；未经第一部分适宜脱细胞方法处理后的新西兰白兔椎间盘材料在植入同种白兔皮下后出现明显中性粒细胞,巨噬细胞,细胞毒性T细胞浸润并出现明显血管生长；FBS10%的DEME-HG(对照组),25%浸提液+DMEM-HG,50%浸提液+DMEM-HG和100%浸提液这四组在活细胞数计数以及细胞活性无明显差异。MSC能在经第一部分适宜脱细胞方法处理后的新西兰白兔椎间盘材料生长,扩增以及迁移。结论：经第一部分适宜脱细胞方法处理后的新西兰白兔椎间盘材料不会引起宿主产生明显的炎症反应以及细胞介导的免疫反应,无体内毒性。材料浸出液及材料对MSC无明显毒性,不影响MSC增殖及迁移,不影响MSC细胞活力。第三部分验证脱细胞椎间盘材料的修复作用目的：验证脱细胞椎间盘能在体外诱导MSC向椎间盘样细胞分化,并且能够在体内试验中有效阻止椎间盘的退变方法：通过扫描电镜(SEM)观察于体外植入脱细胞椎间盘材料后MSC的形态变化,并且用RT-PCR的方法测定MSC中椎间盘细胞相关基因(包括Col Ⅱ, Col Ⅰ,SOX-9,GPC3,AGN)的表达情况,来判断MSC是否向椎间盘样细胞分化。体外实验部分使用新西兰大白兔,用针穿刺椎间盘制造椎间盘退变模型。L3-L4为阴性对照组,造模后注入生理盐水；IA-L5为实验组,遣模后植入脱细胞椎间盘颗粒；L5-L6为空白对照组。然后分别观察0、1、2、3月份的椎间盘含水量以及椎间盘高度。H&E染色、阿尔新蓝染色观察椎间盘微观结构。结果：SEM显示植入MSC的脱细胞椎间盘内可观察到椎间盘样细胞,且RT-PCR结果显示植入后的MSC较平板培养的MSC椎间盘细胞相关基因表达上调,如II型胶原(col Ⅱ)、蛋白多糖(AGN)、SOX-9和GPC3,而软骨相关基因I型胶原(Col Ⅰ)表达不增加。体内试验部分,实验组与阴性对照组组相比保持更高的水化程度,MRI显示实验组的椎间盘高度减小情况也略优于阴性对照组。总体来说,实验组的含水量指数和椎间盘高度的减少在一定程度上得到改善。虽然实验组H&E染色显示媵原蛋白的组织学形态与对照组相比无明显的变化,但是阴性对照组,AF的内层失去了同心层状结构并伴有裂缝,而NP也结构紊乱。阿尔新蓝染色还显示阴性对照组的GAGs明显减少,但在实验治疗组这种减少不明显。结论：脱细胞椎间盘可以阻止椎间盘变性。