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研究背景:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最常见的革兰阳性致病菌,可以引起人体种类众多的感染。而且,随着抗生素的广泛使用,耐药性问题越来越严重。万古霉素作为治疗耐药金黄色葡萄球菌感染的最后一道防线,也出现了敏感性降低,甚至完全耐药的现象。其实,人类的自身先天免疫系统是有效抗击外来微生物入侵的第一道防线。其中一种重要的机制就是诱导性一氧化氮合成酶系统,其所合成的NO~*可以直接抑制微生物的有氧呼吸能量代谢,并抑制微生物的DNA复制。而金黄色葡萄球菌区别于其他非致病性葡萄球菌的一个主要特征,就是可以抵抗NO~*的毒性,在外源性NO~*压力下仍能生长和繁殖。其NO~*解毒机制一方面与黄素血红蛋白(hmp SACOL0220)行使的NO~*双氧化酶功能有关,可以将毒性NO~*转化为无毒的硝酸;另一方面与hmp同处于一个操纵子中的金黄色葡萄球菌乳酸脱氢酶-1(ldh-1 SACOL022)的诱导高表达密切相关。ldh-1与金黄色葡萄球菌中持续表达的同功酶ldh-2可以改变金黄色葡萄球菌在NO~*生存环境下细菌的能量代谢途径,从而使金黄色葡萄球菌可以在NO~*环境压力下正常生长和繁殖。研究思路:理论上ldh-1蛋白可以作为一个抗金黄色葡萄球菌的潜在靶点,任何对ldh-1具有选择性抑制作用的小分子物质,即只抑制金黄色葡萄球菌ldh-1但对人类的乳酸脱氢酶同功酶无明显抑制作用,就可能成为一种新的抗生素。研究方法:本研究首先将金黄色葡萄球菌中编码ldh-1和ldh-2的基因全长克隆到表达载体pET-28a中,大量表达重组蛋白,再利用重组蛋白的Histag,以亲和层析法和分子筛两步联合方法纯化重组蛋白纯度超过95%。进而,在不同理化条件下促使蛋白结晶,然后用所得到的单晶进行X射线衍射以解析蛋白的三维机构。研究结果:l;dh-1蛋白结晶,并收集高质量衍射数据。初步分析属于C2空间群,晶胞参数为a=131.36,b=74.362,c=103.243。ldh-1的结构最终可以被精修到2.2 (?),R-Factor为17%,Rfree-factor为23.4%。使用分子置换法解析出其三维结构,分辨率达2.2埃。每个晶胞中有两个不对称的乳酸脱氢酶分子。每个ldh-1分子中包含两个结构域。大的结构域由22-160和248-264号氨基酸形成具有典型Rossmann特征的折叠。通过蛋白一级结构氨基酸序列的多重序列比对,活性位点的关键氨基酸序列保守,但活性环区上翘,使活性位点更加暴露。本研究还对ldh-1、ldh-2、人类骨骼肌ldh-A和心肌ldh-B的酶催化活性进行了比较,发现ldh-1与底物和辅酶的亲和性,和反应效率均明显高于人类的同功酶。通过对金黄色葡萄球菌中1dh结构、功能的研究,希望能以酶结构为基础,使用工作站筛选相关类别的小分子数据库,发现潜在的结构抑制剂。