输血在挽救大出血等创伤或手术患者生命中发挥不可替代的作用。储存红细胞(storage RBC)是临床应用最广泛的库存血液成分,红细胞在CPDA保存液中可低温储存42天,但会发生ATP、2,3-DPG和NO耗竭、氧亲和力增加等变化,称为红细胞的储存损伤,并随储存时间逐步加重。大量的临床调查数据表明,输注储存时间较长的红细胞与患者的发病率与死亡率密切相关,其机制是研究的热点。以往的研究曾认为储存损伤可能使血红蛋白结构发生改变,从而造成红细胞向组织供氧的能力降低;红细胞膜的变化使得其易破碎溶血,引起铁超载及炎症反应;恶化的变形性易使红细胞堵塞微血管,从而会加剧机体缺氧等。但目前为止,关于红细胞储存损伤可能引起的不良后果与确切机制尚有待进一步研究。随着生物力学研究逐渐兴起,红细胞力学特性的研究也逐步成为热点,其储存过程中力学特性的变化获得关注。近年来的研究结果促使我们形成这样的假说,储存所造成的红细胞力学特性的改变可能是引起输血不良反应的关键因素。红细胞力学特性的变化在储存早期即发生且不可逆,作为血液的主要有形成分,力学特性发生变化的红细胞在输注后极有可能通过改变血液的流变学特性进一步影响血流动力学,最终决定微循环灌注效果及红细胞供氧功能的发挥。这一假说的研究有助于阐明输血不良反应发生的机制,为提高红细胞储存质量和输血效果提供理论基础,但还需要逐一解决以下科学问题。首先,红细胞储存过程中力学特性的变化规律有待明确,而研究这一问题急需建立适用性强的红细胞力学特性检测方法。由于检测方法的差异与不足,对红细胞力学特性的研究获得的结果并不一致。红细胞力学特性的检测设备与方法虽然经过多年研究,但仍存在很多不足。如激光衍射法难以获得单个红细胞变形性变化,且需要借助高粘度缓冲液而增加了结果复杂性;微管吸吮法可操作性差,耗时长,分析方法复杂,不适于在线检测。目前文献中多用微流设备表征红细胞变形能力。但从目前研究结果看,这些设备尚不能逼真地模拟微循环过程,检测结果也不一致。因此,需要针对储存红细胞力学特性检测方法进行进一步研究。其次,不同体液环境等外部因素对红细胞力学特性的影响需要明确。临床上输血与输液常同时进行。常用的血浆扩容剂包括右旋糖酐类、羟乙基淀粉类以及明胶类等,这些糖类或蛋白大分子对红细胞的力学特性,尤其是聚集性有一定影响。糖类及蛋白质大分子可与红细胞表面吸附发生桥联作用,引起红细胞聚集,聚集程度因吸附的分子大小、结构的不同而异。而血浆扩容剂大分子在循环状态下对于储存红细胞的聚集性究竟有何影响尚不明确,哪种血浆扩容剂与储存红细胞配伍使用更加合理有待进一步验证。第三,储存红细胞对血液流动的影响对于预测不良反应的发生具有重要意义,需要进一步研究。红细胞作为血液的主要成分(~45%),其力学特性的变化必然会直接影响血流状态。如,红细胞聚集增强、变形下降会造成血液流动时阻力增大,甚至会堵塞毛细血管,引起微循环障碍。因此,储存过程中红细胞力学特性的改变会通过血流进一步影响不同储存时间红细胞输注后的效果。但由于技术局限,目前还难以量化红细胞力学特性与各种血流参数之间的关系。近年来兴起的计算流体力学能够依托软件构建二维血管,依据红细胞力学参数模拟其在血管中的流动状态,可以真实且量化地反映红细胞力学特性与血流各参数之间的关系。因此,可借助这一方法明确红细胞储存中力学特性的变化对血液流动的影响。第四,红细胞力学特性的改变可能与其储存过程中力学微环境的缺失有关,是否可通过改变力学环境降低红细胞损伤值得进一步探索。红细胞的平均寿命为120天,但其在cpda保存液中仅能储存42天。保存液虽然可以为红细胞提供丰富的能量底物,但仍避免不了储存损伤的发生,这可能与储存环境下缺失的力学微环境有关。红细胞在血液循环中,每时每刻均处于复杂的力学微环境中,并受其调节。首先,红细胞自身某些因子,如cd47表达受剪应力调节。其次,剪应力还能够调节红细胞膜上的葡萄糖转运蛋白,调节红细胞代谢。所以,我们推测体外储存中力学微环境的缺失极有可能是造成红细胞储存损伤的重要因素。这一假说需要通过实验进行预探索。综上所述,研究储存红细胞力学特性变化对于阐明输血效果及不良反应发生中的机制具有重要意义。本研究拟通过完善红细胞力学特性检测方法,明确储存红细胞力学特性变化规律及血浆扩容剂等外部因素的影响,并通过计算流体力学的模拟实验,明确该变化对于血液流动的影响,从而为阐明输血不良反应发生的机制提供理论基础。此外,本研究还大胆假设,提出改变力学微环境可作为提高红细胞储存质量的一大策略,并对这一假设进行预探索。主要研究内容如下:第一章小鼠红细胞储存损伤模型的建立适当的红细胞储存损伤模型是研究红细胞力学特性的前提。小鼠红细胞储存损伤模型曾被广泛应用,且该模型相对于人血具有成本低、可获得性强、储存周期较短的优势,更重要的是能够在后期研究中实现体外研究结果的动物体内验证,便于后续研究的进行。因此本章的主要目的是建立c57小鼠红细胞体外储存损伤模型,为后续研究奠定基础。红细胞以cpda-1作为保存液于4℃储存,分别于储存的0d、7d、14d对其进行检测,观察红细胞储存后的生物化学参数及形态、功能等的变化。同时,尝试建立储存红细胞拉曼光谱检测方法,对储存红细胞的血红蛋白结构进行表征。通过研究我们成功建立了c57小鼠红细胞体外储存损伤模型及其拉曼光谱检测方法;该模型中红细胞储存14d时生化指标、血氧指标、血液学指标及血红蛋白结构与功能等都发生显著变化,与储存42d的人红细胞损伤程度相似,可以用于后期力学特性的研究。第二章储存红细胞力学特性表征本研究拟对检测技术进行完善,明确红细胞储存过程中的变形性等力学参数的变化规律。同时,采用粘度法进行检测,明确红细胞聚集性受储存及血浆扩容剂等内部、外部因素的影响。首先,建立基于基底小窝的afm检测方法,将储存红细胞物理固着并进行检测。结果显示,随着储存时间延长,红细胞杨氏模量降低。该结果与预期的变化趋势并不一致,考虑可能为红细胞的特殊形状影响检测结果。但该方法仍可作为悬浮细胞的afm检测方法进行应用。其次,建立基于微流通道的储存红细胞力学特性检测方法。使用多聚赖氨酸将红细胞粘附于微流道底面,使用pbs剪切红细胞,通过其受力产生的形变进行分析,获得红细胞力学特性参数。该方法不需借助高速摄像机,具有样品用量少、高通量及操作简便等优势,适用于红细胞力学特性的在线检测。检测结果显示:随储存时间延长,红细胞变形指数(di)降低、剪切后形态分布发生变化、表面电荷数减少、杨氏模量明显增大。最后,储存红细胞粘度与聚集指数变化规律及其受血浆扩容剂的影响。取储存0d、7d、14d的红细胞检测样品粘度,计算聚集指数(ai)。并将储存红细胞分别与hes40、hes130、hes200、gel混合,明确液体环境对其粘度和聚集指数的影响。结果显示:红细胞悬液粘度和ai随储存时间延长有先升高后降低的现象。血浆扩容剂对新鲜红细胞无显著影响,但对储存红细胞影响较大,且因种类和储存时间而异。第三章储存红细胞力学异质性影响血流的数字模拟为了明确储存红细胞力学特性改变对血液流动的影响,本研究拟采用体外模拟的方法,借助计算流体力学软件,建立红细胞与血管的二维模型(尺度为50μm×10μm,进口流速为0.001m/s),将第二章中获得的红细胞杨氏模量代入模型,计算红细胞运动状态及血流的各项参数。通过单细胞在毛细血管中流动的模拟计算,证明储存时间较长的红细胞由于其力学性质的差异,会引起压力降幅度增大、流速降低、静流层宽度降低及壁面剪应力增高等变化,这可能是其易导致输注无效或引起输血不良反应发生的机制之一。第四章剪应力保护红细胞储存损伤的作用研究为了验证力学微环境改变对红细胞储存质量的影响,本研究对不同储存期的红细胞提供短暂的剪切环境(1.384pa的剪应力作用30min),观察储存红细胞形态、膜蛋白表达与定位及血红蛋白功能等的变化。结果显示:随储存时间延长,部分红细胞逐渐呈现棘形,经剪切后恢复其双凹圆盘形状;随储存时间延长膜蛋白band4.9+5比例显著增高,而band3比例显著降低,并在红细胞膜上有聚簇现象,经剪应力作用后,band4.9+5比例回落,而band3重新均匀分布。该结果提示可通过提供剪应力改变储存红细胞质量,从而调节输血效果及减少输血不良反应的发生。小结本研究着眼于红细胞储存中的力学特性变化及其对红细胞流动特性和功能的影响,针对具体科学问题进行研究,取得的主要进展及意义如下:首先,在c57小鼠红细胞储存损伤模型建立过程建立了储存红细胞拉曼光谱检测方法。拉曼光谱可表征血红蛋白结构与功能、铁离子自旋态、卟啉环中心孔径等变化,灵敏度高,简便易操作,有望替代血氧、p50等多个参数应用于临床。其次,通过afm检测方法的优化和微流检测方法的建立两条途径明确储存红细胞力学特性的变化。底面小窝图案的afm方法应用于红细胞检测的可行性虽有待商榷,但其在其他悬浮细胞的检测中具有应用价值;微流检测方法不仅可获得储存红细胞变形指数分布、形状分布等规律,还可使用流场中红细胞尾部曲率作为储存红细胞表面电荷的表征参数,并借助计算模型获得储存红细胞杨氏模量。该方法简便、易操作、无需借助高速摄像头,能够多角度区分储存红细胞的力学特性,有望作为储存红细胞质量监测方法应用于临床。第三,明确了红细胞储存过程中聚集指数的变化规律及不同血浆扩容剂的影响。结果显示储存红细胞粘度和聚集指数的影响随储存时间及扩容剂种类而异。该结果提示我们,在进行输血、输液救治时,应根据患者具体血液流变特点选择血浆扩容剂,对临床紧急救治具有指导意义。第四,建立红细胞与血管的计算流体力学模型,明确储存红细胞力学特性改变对流动的具体影响。这一研究改变了以往通过红细胞聚集、变形等抽象数值推测其效应的方法,实现了从红细胞力学特性到血液流动具体参数的对接,不仅可为阐述储存红细胞输血不良反应发生的机制提供基础,还可为输血效应及输血不良反应的发生提供预测。最后,我们探索了力学微环境对储存红细胞的影响。短暂的剪应力可调整储存红细胞蛋白表达及分布,说明剪应力可作为保护红细胞储存损伤的候选方法。这一研究结果颠覆了以往红细胞需要静止保存的理论观点,可为临床提高红细胞储存质量提供新的策略。综上所述,本研究建立了适宜的红细胞力学特性检测方法,明确了红细胞储存过程中的力学特性变化规律,阐明了该变化对血液流动的直接影响,并对改善红细胞储存损伤的新策略进行了预探索。这些结果可为临床提高红细胞储存质量,精准预测输血效果及降低输血不良反应的发生提供理论基础,具有创新性及实用价值。