背景浆细胞样树突状细胞(Plasmocytoid dendritic cells,p DCs)是树突状细胞的一个亚类,主要来源于骨髓、外周血及T细胞丰富的淋巴组织。在所有类型的细胞中,p DCs细胞产生I型干扰素的能力最强。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)依赖性通路已被证明系p DCs细胞产生I型干扰素的主要通路。在病毒等刺激下,人体的p DCs细胞有选择性地高水平表达Toll样受体(包括TLR9),进而合成与释放大量I型干扰素。而I型干扰素异常增多与多种自身免疫性疾病的发生有关。因此,人体因p DCs细胞凋亡缺陷会导致自身免疫能力过强引起自身免疫性疾病,例如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等。SLE是一种多系统损伤的自身免疫性疾病,以T、B细胞异常活化、补体激活、免疫复合物清除障碍、自身抗体的产生及免疫调节异常为特点。SLE全世界发病率为0.3‰-0.8‰。已有研究表明,I型干扰素(inteferon I,IFN I)通路异常活化在SLE发病发展中起着重要作用。然而,SLE的发病机制十分复杂,目前尚未被完全阐明。目前SLE的治疗主要是采用糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)等免疫抑制剂。GCs可诱导免疫细胞凋亡因而经常被用于治疗许多与炎症和自身免疫性疾病相关的病症,但因为具有导致骨质疏松甚至骨折、股骨头坏死、胃肠道出血、继发感染等副作用从而限制了GCs的使用。GCs通过诱导p DCs细胞凋亡降低I型干扰素的表达是其治疗SLE等自身免疫性疾病的重要机制之一。Toll样受体中的TLR9与来自病毒等的非甲基化Cp G(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸序列)结合后会被激活。TLR9被激活后即可活化p DCs细胞并可抑制p DCs细胞凋亡,这一过程对GCs诱导的p DCs细胞凋亡具有抵抗作用,从而降低了GCs治疗I型干扰素相关性自身免疫性疾病(如SLE等)的疗效。因此,弱化Toll样受体功能的物质可能有助于提高GCs在治疗例如SLE等自身免疫性疾病时的疗效。越来越多的研究表明,Bcl-2基因家族在调控p DCs细胞凋亡方面发挥着重要作用,但不同的成员所起的作用不同。例如Bcl-2家族中的抗凋亡基因Bcl-2即对p DCs细胞凋亡有显著性抑制作用;而Bcl-xl对p DCs细胞凋亡无明显影响。Bcl-2家族中的其它抗凋亡基因Mcl-1,Bcl-w等对p DCs细胞凋亡是否有影响未见报道。由于Toll样受体被激活后亦可显著抑制p DCs细胞凋亡,故有必要对Toll样受体与Bcl-2家族中抗凋亡基因间的关联性进行研究。mi RNAs是能与靶m RNA 3’端非翻译区互补序列碱基配对从而在转录后水平对基因表达进行负向调节的内源性小的非编码RNA。最近已有文献表明在免疫应答和炎症因子的信号传导过程中mi RNAs都起着重要的调节作用。有研究报道SLE患者中干扰素通路异常活化可能与某些mi RNAs异常表达有相关性。GCs治疗SLE等自身免疫性疾病的重要机制系通过一系列mi RNAs对p DCs细胞起促凋亡作用,但Toll样受体对这一过程起抵抗作用。因而为了增强GCs对p DCs细胞的促凋亡作用,提高其治疗SLE等自身免疫性疾病的疗效,我们需要对Toll样受体抵抗GCs促p DCs细胞凋亡的机制进行研究,找寻其中关键的mi RNAs分子。方法本课题选用地塞米松(Dex)、TLR9配体(Cp G)、p DCs细胞等进行细胞学实验。(1)从76个健康志愿者外周血中分离出外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),采用人p DCs细胞分离试剂盒分离获得纯度大于95%的人原代p DCs细胞;将获得的p DCs细胞在37℃细胞培养箱中恢复两个小时。之后,进行分组刺激:无刺激组、Dex(Dex,10-4 M)刺激组、Dex(Dex,10-4 M)+Cp G(5μM)刺激组。所有p DCs细胞培养和刺激过程均加用20 ng/m L IL-3维持细胞的生存。在刺激4-16小时后收集样本进行相关检测。(2)利用mi RNA Microarray高通量检测无刺激组、Dex刺激组、Dex+Cp G刺激组mi RNAs的差异表达情况;并通过碱基互补程度预测分析,从所有检测到的mi RNAs中筛选出有可能与BCL-2家族抗凋亡基因BCL-2,Bcl-xl,Mcl-1,Bcl-w结合的候选mi RNAs。(3)设置无刺激对照组,以及Cp G刺激组;同时采用western blot及q RT-PCR方法检测两组p DCs细胞中Bcl-2,Bcl-xl,Mcl-1的蛋白表达,以及Bcl-2,Bcl-xl,Mcl-1,Bcl-w m RNAs的表达,旨在了解Cp G刺激对上述抗凋亡基因的影响。(4)将一段没有意义的小RNA分子转染p DCs细胞作为Ctrl组,接着将Mcl-1特异的si RNA(si-Mcl-1)转染p DCs细胞以沉默Mcl-1作为si-Mcl-1组;另外,采用si-Mcl-1转染p DCs细胞后,再加以Cp G刺激作为si-Mcl-1+Cp G组,同时以Cp G刺激p DCs细胞作为Cp G刺激组。之后,采用Annexin-V和PI双荧光标记法检测每组p DCs细胞的凋亡率、存活率。目的是了解在无/有Cp G刺激条件下Mcl-1对p DCs细胞凋亡的影响。(5)同时设置对照组(转染了一段无意义的小RNA分子)、Dex刺激组、Dex+Cp G刺激组、mi RNA mimic+Dex+Cp G组。在mi RNA mimic+Dex+Cp G组,分别向p DCs细胞转染5个候选mi RNAs(mi R-29b,mi R-29c,mi R-101,mi R-148a,和mi R-1)的mimics后采用Dex+Cp G刺激。接着利用双凋亡方法检测每组中p DCs细胞的凋亡与存活情况。目的是验证Dex的诱导p DCs细胞凋亡作用;验证Cp G抵抗Dex诱导的p DCs细胞凋亡作用;了解在Dex+Cp G共同刺激条件下,5个候选mi RNAs过表达时对p DCs细胞凋亡的影响。(6)进一步地,以Dex刺激组作为对照组;采用mi R-29b,mi R-29c的特异性反义互补链mi R-29b inhibitor,mi R-29c inhibitor分别转染p DCs细胞沉默mi R-29b/c后加以Dex刺激作为mi R-29b/c inhibitor+Dex组。并检测三组p DCs细胞的凋亡率与存活率,以了解mi R-29b/c在Dex诱导p DCs细胞凋亡过程中的作用。(7)最后,将mi R-29b mimic转染p DCs细胞,用western blot法检测Bcl-2及Mcl-1蛋白的动态表达以验证mi R-29的靶基因;同时还检测了在Cp G刺激下mi R-29b,mi R-29c于p DCs细胞的时相性表达。结果(1)在p DCs细胞中,共有120种mi RNAs的表达被Dex诱导上调(均上调≥1倍);表达受Dex抑制的mi RNAs有83种(均下调≥1倍);在受Dex抑制的83种mi RNAs中被Cp G上调表达的有20种(均上调≥1倍);在受Dex诱导表达增强的120种mi RNAs中被Cp G下调表达的有36种(均下调≥1倍)。该结果显示共计56种mi RNAs有可能在Cp G抑制Dex促p DCs细胞凋亡过程中起了重要作用。(2)通过靶基因预测显示这56种mi RNAs中有6种(mi R-29c,mi R-29b,mi R-101,mi R-148a,mi R-1,mi R-let-7a)mi RNAs有可能作用于Bcl-2家族中的抗凋亡基因(Bcl-2,Bcl-xl,Mcl-1,Bcl-w),这6种mi RNAs成为重点研究的候选mi RNAs。(3)与无刺激对照组相比,Cp G刺激组Bcl-2,Mcl-1,Bcl-xl蛋白表达均显著增加(P<0.05),且Bcl-2 m RNA,Bcl-xl m RNA的表达亦显著增加(P<0.05),Mcl-1m RNA的表达有轻度减少但无统计学意义(P>0.05),Bcl-w m RNA的表达未受Cp G刺激影响。(4)在si-Mcl-1组,Mcl-1沉默后检测到p DCs细胞凋亡率由Ctrl组的18.9%增长到59.1%(增长>2倍),p DCs细胞的存活率却由Ctrl组的49.2%下降到24.4%(下降>1倍);在si-Mcl-1+Cp G组,p DCs细胞的存活率由Cp G刺激组的51.3%下降至32.9%,凋亡率由Cp G刺激组的14.9%升高至42.0%。(5)在Dex刺激组,p DCs细胞的凋亡率由对照组的19.3%提高到75.2%,p DCs细胞的存活率却由对照组的51.1%下降到12.0%;在Dex+Cp G刺激组,p DCs细胞的凋亡率由Dex刺激组的75.2%下降到21.1%,p DCs细胞的存活率却由Dex刺激组的12.0%提高到50.2%;在mi RNA mimic+Dex+Cp G组,mi R-29b和mi R-29c的过表达使p DCs细胞的凋亡率由Dex+Cp G刺激组的21.1%分别提高到58.4%和52.7%(均提高>1倍),而mi R-101,mi R-148a,mi R-1过表达后对Dex+Cp G刺激组p DCs细胞的凋亡率无显著性影响(均P>0.05)。(6)在mi R-29b/c inhibitor+Dex组,mi R-29b/c被沉默后,检测到p DCs细胞凋亡率由Dex刺激组的58.1%分别下降到35.2%/36.5%(与Dex刺激组相比P<0.05)。(7)在验证mi R-29的靶基因时发现,p DCs细胞接受mi R-29b mimic转染后Mcl-1,Bcl-2的蛋白表达都能够被显著抑制,且在p DCs细胞接受mi R-29b mimic转染后6小时点mi R-29b对Mcl-1的蛋白表达即有显著抑制,但对Bcl-2的蛋白表达要到12小时点方有明显抑制;而以Cp G刺激p DCs细胞,检测到在Cp G刺激6小时点mi R-29b,mi R-29c表达受抑制最为明显,之后mi R-29b,mi R-29c的表达逐渐缓慢恢复,但到12小时刺激点仍远远无法恢复到0刺激点水平。结论(1)GCs能够诱导p DCs细胞显著凋亡,而Toll样受体能够明显抵抗GCs的这种作用。(2)GCs发挥诱导p DCs细胞凋亡作用的主要途径系通过刺激p DCs细胞增加表达mi R-29b,mi R-29c实现的。(3)mi R-29b,mi R-29c通过抑制Bcl-2,Mcl-1抗凋亡基因的蛋白表达促进p DCs细胞的凋亡;且mi R-29b对p DCs细胞凋亡有持续性促进作用,在转染mi R-29b mimic后6小时以内主要是通过抑制Mcl-1抗凋亡基因发挥促凋亡作用,在6小时后则逐渐转换成主要通过抑制Bcl-2抗凋亡基因发挥促凋亡作用。(4)Bcl-w基因因其m RNA不受Cp G刺激的影响,所以推测其并未参与Toll样受体抑制GCs促p DCs细胞凋亡过程。(5)Toll样受体抑制mi R-29b,mi R-29c的表达是Toll样受体抵抗GCs诱导p DCs细胞凋亡的重要途径。(6)mi R-29b,mi R-29c可以作为新的靶点,以研制提高GCs治疗SLE等自身免疫性疾病疗效的新药物。